核酸样品制备方法技术

本文公开的技术方面涉及制备和分析核酸的方法。在一些实施方案中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸样品制备方法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,339的优先权，其通过引用整体并入本文。
本文描述的技术涉及可用于制备用于分析的核酸分子的方法和组合物。
技术介绍
在下一代测序之前的靶标富集比全基因组、全外显子组和整个转录组测序更具成本效益，因此对于用于研究发现和临床应用的广泛实施更加实用。例如，由靶标富集方法提供的高覆盖深度使等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)和低频突变的检测能够具有更宽的动态范围，这有利于评估癌症中的体细胞突变。用于下一代测序的当前富集方案的实例包括基于杂交的捕获测定(TruSeqCapture，Illumina；SureSelectHybridCapture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的测定(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，IonTorrent；TruSeqAmplicon，Illumina；emulsion/digitalPCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获由捕获探针覆盖的靶序列，而且捕获消耗测序能力的脱靶基因附近。另外，这些方法相对耗时、劳动强度大，并且具有相对低的特异性水平。专利技术概述本文公开的技术方面涉及制备和分析核酸的方法。在一些实施方案中，本文提供了可用于制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸样品的方法和组合物。在一些实施方案中，本文描述的技术涉及确定核酸序列的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及在测序之前富集包含一种或更多种靶核苷酸序列的核酸。在一些方面，本公开内容提供了制备核酸(例如，用于测序分析)的方法，其涉及将一个或更多个以捕获部分修饰的核苷酸添加至核酸。在一些实施方案中，该方法还涉及将衔接子核酸与已添加以捕获部分修饰的核苷酸的核酸连接以产生连接产物。在一些实施方案中，该方法还涉及通过使连接产物与以捕获部分修饰的核苷酸的捕获部分的结合配偶体接触来捕获连接产物。在一些实施方案中，该方法还涉及扩增连接产物，例如通过聚合酶链式反应或另外的合适的扩增方法。在一些实施方案中，提供了用于制备核酸的方法，所述核酸涉及将一个或更多个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的核酸(例如，双链核酸)的3’端，其中一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸。在一些实施方案中，在核酸的3’端存在以捕获部分修饰的核苷酸有助于核酸的分离、纯化和/或洗涤，同时避免在整个核酸中并入经修饰的核苷酸(例如，随机地)。在一些实施方案中，提供了用于制备核酸的方法，其涉及将一个或更多个核苷酸并入包含靶核苷酸序列的核酸(例如，双链核酸)中，其中所述一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸。在一些实施方案中，使用引物(例如，逆转录引物)并入一个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，在制备核酸的早起步骤期间并入一个或更多个核苷酸。例如，在一些实施方案中，在片段化、随机引发、第一链合成、第二链合成和/或末端修复期间并入一个或更多个核苷酸。在一些方面，本公开内容提供了制备用于分析的核酸的方法，其中所述方法包括：(a)将一个或更多个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的双链核酸的3’端，其中一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸；(b)将衔接子核酸与已添加以捕获部分修饰的核苷酸的双链核酸连接以产生连接产物，其中位于衔接子核酸的3’端的一个或更多个核苷酸的序列与步骤(a)中添加至双链核酸的3’端的一个或更多个核苷酸互补；(c)通过使连接产物与以捕获部分修饰的核苷酸的捕获部分的结合配偶体接触来捕获连接产物；(d)通过聚合酶链式反应使用与靶核苷酸序列特异性退火的第一靶特异性引物和与衔接子核酸的互补序列特异性退火的第一衔接子引物来扩增连接产物。在一些实施方案中，步骤(b)包括在连接酶连接衔接子核酸与双链核酸的条件下组合衔接子核酸、双链核酸和连接酶。在一些实施方案中，与双链核酸组合的衔接子核酸包含双链体部分和单链突出端(overhang)序列。在一些实施方案中，单链突出端序列包含位于衔接子核酸的3’端的一个或更多个核苷酸的序列，其与步骤(a)中添加至双链核酸的3’端的一个或更多个核苷酸互补。在一些实施方案中，步骤(b)包括在连接酶连接衔接子核酸与双链核酸的条件下组合衔接子核酸、双链核酸和连接酶，其中与双链核酸组合的衔接子核酸是单链的。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括：(e)通过聚合酶链式反应使用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增步骤(d)的扩增产物。在一些实施方案中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套(nested)。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含不与靶核苷酸序列退火的5’尾。在一些实施方案中，该方法还包括添加另外的引物，其包含与第二靶特异性引物的5’尾相同的3’部分。在一些实施方案中，捕获部分是生物素部分。在一些实施方案中，生物素部分包含生物素-三甘醇、双-生物素、可光裂解生物素、脱硫生物素、脱硫生物素-三甘醇或生物素叠氮化物。在一些实施方案中，以捕获部分修饰的核苷酸包含选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶的核碱基，或其衍生物。在一些实施方案中，以捕获部分修饰的核苷酸包含腺嘌呤核碱基或其衍生物。在一些实施方案中，捕获部分与腺嘌呤核碱基或其衍生物的第5、6、7或8位处共价连接。在一些实施方案中，捕获部分与腺嘌呤核碱基的第7位处共价连接。在一些实施方案中，腺嘌呤核碱基中的第7位是碳原子。在一些实施方案中，生物素部分通过任何合适长度的接头与核碱基共价连接。在一些实施方案中，生物素部分与核碱基共价连接，例如，通过长度为5至20个原子的接头(例如，长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个原子)。在一些实施方案中，以捕获部分修饰的核苷酸是生物素-n-dNTP，其中n是5至20的整数，其代表生物素部分的羰基与NTP核碱基上的附接位置之间的接头原子数。在一些实施方案中，结合配偶体是链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，链霉抗生物素蛋白与顺磁珠附接。在一些实施方案中，在步骤(a)中，将一个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的双链核酸的3’端。在一些实施方案中，方法还包括纯化非特异性核酸。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括在步骤(b)之后和在步骤(c)之前的反应净化或洗涤步骤。在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(c)之后和在步骤(d)之前：i)将包含以捕获部分修饰的核苷酸的双链核酸固定在顺磁性基底或表面上(例如，聚苯乙烯顺磁珠)；和ii)洗涤经固定的双链核酸。在一些实施方案中，该方法在步骤(ii)之后还包括：iii)从顺磁性基底或表面释放经洗涤的经固定的双链核酸。在一些实施方案中，经洗涤的经固定的双链核酸通过与化学试剂接触和/或施加热量而从顺磁性基底或表面释放。在一些实施方案中，化学试剂是碱或碱性溶液。在一些实施方案中，化学试剂包含氢氧化钠(NaOH)。应当理解，在一些实施方案中，接触可包括混合两种溶液(例如，一种溶液包含碱，另一种溶液包含经洗涤的经固定的核酸)、向溶液中添加固体，或向固体中添加溶液。在一些实施方案中，经洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)将一个或更多个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的双链核酸的3’端，其中所述一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸；(b)将衔接子核酸与已添加所述以捕获部分修饰的核苷酸的所述双链核酸连接以产生连接产物，其中位于所述衔接子核酸的3’端的一个或更多个核苷酸的序列与在步骤(a)中添加至所述双链核酸的3’端的所述一个或更多个核苷酸互补；(c)通过使所述连接产物与所述以捕获部分修饰的核苷酸的结合配偶体接触来捕获所述连接产物；以及(d)通过聚合酶链式反应使用与所述靶核苷酸序列特异性退火的第一靶特异性引物和与所述衔接子核酸的互补序列特异性退火的第一衔接子引物扩增所述连接产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.15 US 62/395,3391.制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)将一个或更多个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的双链核酸的3’端，其中所述一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸；(b)将衔接子核酸与已添加所述以捕获部分修饰的核苷酸的所述双链核酸连接以产生连接产物，其中位于所述衔接子核酸的3’端的一个或更多个核苷酸的序列与在步骤(a)中添加至所述双链核酸的3’端的所述一个或更多个核苷酸互补；(c)通过使所述连接产物与所述以捕获部分修饰的核苷酸的结合配偶体接触来捕获所述连接产物；以及(d)通过聚合酶链式反应使用与所述靶核苷酸序列特异性退火的第一靶特异性引物和与所述衔接子核酸的互补序列特异性退火的第一衔接子引物扩增所述连接产物。2.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括在连接酶将所述衔接子核酸与所述双链核酸连接的条件下组合所述衔接子核酸、所述双链核酸和所述连接酶，其中与所述双链核酸组合的所述衔接子核酸包含双链体部分和单链突出端序列，其中所述单链突出端序列包含位于所述衔接子核酸的3’端的一个或更多个核苷酸的序列，其与步骤(a)中的添加至所述双链核酸的3’端的所述一个或更多个核苷酸互补。3.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括在连接酶将所述衔接子核酸与所述双链核酸连接的条件下组合所述衔接子核酸、所述双链核酸和所述连接酶，其中与所述双链核酸组合的所述衔接子核酸是单链的。4.权利要求1所述的方法，其还包括：(e)通过聚合酶链式反应使用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增步骤(d)的扩增产物。5.权利要求4所述的方法，其中所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套。6.权利要求4或5所述的方法，其中所述第二靶特异性引物包含不与所述靶核苷酸序列退火的5’尾。7.权利要求6所述的方法，其还包括添加另外的引物，所述另外的引物包含与所述第二靶特异性引物的5’尾相同的3’部分。8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获部分是生物素部分。9.权利要求8所述的方法，其中所述生物素部分包含生物素-三甘醇、双-生物素、可光裂解生物素、脱硫生物素、脱硫生物素-三甘醇或生物素叠氮化物。10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述以捕获部分修饰的核苷酸包含选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶的核碱基，或其衍生物。11.权利要求10所述的方法，其中所述以捕获部分修饰的核苷酸包含腺嘌呤核碱基或其衍生物。12.权利要求11所述的方法，其中所述捕获部分与所述腺嘌呤核碱基或其衍生物的第5、6、7或8位处共价连接。13.权利要求12所述的方法，其中所述捕获部分与所述腺嘌呤核碱基的第7位处共价连接。14.权利要求13所述的方法，其中所述腺嘌呤核碱基的第7位是碳原子。15.权利要求10所述的方法，其中所述生物素部分通过长度为5至20个原子的接头与所述核碱基共价连接。16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述以捕获部分修饰的核苷酸是生物素-n-dNTP，其中所述n是5至20的整数，其代表所述生物素部分的羰基和所述NTP的核碱基上的附接位置之间的接头原子数。17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合配偶体是链霉抗生物素蛋白。18.权利要求17所述的方法，其中所述链霉抗生物素蛋白与顺磁珠附接。19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，将一个核苷酸添加至包含所述靶核苷酸序列的所述双链核酸的3’端。20.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在步骤(b)之后和在步骤(c)之前的洗涤步骤。21.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在步骤(c)之后和在步骤(d)之前：i)将包含所述以捕获部分修饰的核苷酸的所述双链核酸固定在顺磁性基底或表面上；以及ii)洗涤经固定的双链核酸。22.权利要求21所述的方法，其还包括在步骤(ii)之后：iii)从所述顺磁性基底或表面释放经洗涤的经固定的双链核酸。23.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在步骤(a)之前，对所述双链核酸进行5’磷酸化。24.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括，在步骤(a)之前：i)通过使用RNA制备物作为模板进行随机引发的第一链合成反应和使用所述随机引发的第一链合成反应的产物作为模板进行第二链合成反应来制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔舒阿·斯塔尔，贾森·迈尔斯，布拉迪·卡尔弗，布赖恩·库德洛，
申请(专利权)人：阿谢尔德克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US