针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法。所述针对HPV 16基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。针对HPV 18基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所述双重侧向流层析试纸条包括支撑板，所述支撑板的上端面包括依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗的检测线T1、T2和质控线C。本发明专利技术公开的检测方法特异性好，灵敏度高，特异性好，重复性好，操作简单，适用性强。

【技术实现步骤摘要】
针对HPV16和HPV18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法
本专利技术涉及一种HPV16和HPV18基因型的检测方法，尤其涉及针对HPV16和HPV18基因型的引物对，一种基于乳胶微球标记原理的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条及相应的检测方法，属于生物医学领域。
技术介绍
癌症的早期诊断和预防一直是临床检测领域亟待解决的问题。作为世界女性群体中发生率和致死率排名第四的癌症，宫颈癌的检测和预防一直受到全世界人们的关注。据估计，在2018年，全世界宫颈癌的新增病例为570000，死亡病例为311000。现有研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)感染实际上是导致宫颈癌的主要原因，超过99％的宫颈癌与高危HPV基因型有关。已有证据表明，以HPV为基础的筛查方法比巴氏涂片能更有效地预防宫颈癌，基于HPV基因型鉴定的方法有望成为宫颈癌早期诊断和预防的首要方法。研究表明，高危HPV基因型有12种，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型。在检出的宫颈癌病例中，以HPV16的检出率为最高，其次是HPV18。综合考虑，开发一种快速、可靠、方便且同时筛查和检测高危HPV16和HPV18基因型的方法具有重要意义。迄今为止，已开发的用于检测HPV基因型的方法有很多，但只有很少的一部分可用于临床诊断。其中，基于免疫学和形态学的检测方法灵敏度不足，且不能区分特定HPV基因型的种类，因此不能满足临床检测和预防的需求；二代杂交捕获技术可以灵敏地检测出13种HPV基因型，但容易产生交叉反应，从而导致假阳性或者检测结果不准确的结果。聚合酶链式反应(PCR)技术得益于其简单的操作和指数的扩增能力，已成为HPV基因型筛查和检测的主要手段。然而依赖于电泳、扩增产物水解后杂交或特殊仪器检测的表征手段极大地限制了PCR技术的广泛应用。其他技术，如微阵列技术和实时聚合酶链反应(real-timePCR)，也需要专门和昂贵的设备，而这些设备可能在资源有限的实验室无法获得，同时需要专业的操作人员进行相关检测工作。因此，专利技术一种简单、方便、灵敏的HPV高危基因型筛查和检测手段，对于基层和硬件匮乏地区的宫颈癌筛查工作的有效开展具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上现状，提供一种针对HPV16和HPV18基因型的引物对，以克服现有技术中的不足。本专利技术的另一主要目的在于提供一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条。本专利技术的另一目的还在于提供一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析检测方法。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种针对HPV16基因型的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。本专利技术实施例还提供了一种针对HPV18基因型的引物对，其包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。本专利技术实施例还提供了一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。本专利技术实施例还提供了前述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其包括：将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。本专利技术实施例还提供了前述的针对HPV16基因型的引物对、针对HPV18基因型的引物对或同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条于制备检测HPV16和HPV18基因型的产品中的用途。进一步地，应用所述产品检测HPV16和HPV18基因型的方法包括：提取待检测HPV样品中的DNA；采用前述的针对HPV16基因型的引物对、针对HPV18基因型的引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；将所获双链DNA产物加入前述的双重侧向流层析试纸条进行检测，根据检测线的显色结果实现待检测HPV样品中HPV16或HPV18的定性或定量检测。与现有技术相比，本专利技术的优点包括：1)本专利技术利用两组分别针对HPV16和HPV18基因型的特异性功能化引物对，根据宫颈癌高危HPV16或HPV18基因型存在时，通过PCR扩增分别获得对应的两端功能化的双链DNA产物，利用不同双链DNA产物的桥接作用，把FITC抗体偶联的乳胶微球分别连接到对应的检测线上，从而实现通过乳胶微球颜色进行检测结果肉眼判断或读卡判断的目的。根据特定高危HPV的含量不同，连接到检测线上的FITC抗体偶联的乳胶微球的数量不同，进而使检测线颜色的深浅不同，建立起检测线颜色的深浅强度与特定HPV含量之间的关系，进而实现一次扩增、加样同时对宫颈癌临床样品中高危HPV16和HPV18基因型进行灵敏筛查和检测的目的；2)本专利技术的检测方法特异性好，灵敏度高(102-103拷贝数)，特异性好，重复性好，操作简单，适用性强，能同时检测到700个拷贝的HPV16DNA和HPV18DNA；3)本专利技术的检测方法不需要特殊贵重仪器，仅需要常规PCR扩增仪及对应的双重侧向流层析试纸条，即可实现同时对宫颈癌高危HPV16和HPV18的快速、准确、同时筛查，适用于基层及检测硬件资源匮乏地区开展相关的宫颈癌普查工作。附图说明图1是本专利技术实施例1中采用侧向层析方法同时筛查和检测宫颈癌高危HPV16和HPV18基因型的灵敏度示意图。具体实施方式鉴于现有宫颈癌HPV基因型筛查和检测方法应用所存在的不足和缺陷，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，建立了一种基于乳胶微球标记原理的同时检测宫颈癌高危HPV16和HPV18基因型的灵敏度高、特异性好且操作简便的双重侧向流层析试纸条及检测新方法，实现更加简单、灵敏、准确地筛查和检测宫颈癌高危HPV16和HPV18基因型。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。下文将对本专利技术的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本专利技术实施例的一个方面提供了一种针对HPV16基因型的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。进一步地，所述针对HPV16基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对HPV16基因型的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一种针对HPV16基因型的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。2.一种针对HPV18基因型的引物对，其特征在于包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。3.一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，其特征在于：所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。4.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述FITC抗体选自FITC的单克隆抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL；和/或，所述乳胶微球为红色或蓝色，粒径为50～200nm；和/或，所述链霉亲和素的浓度为0.5～1.0mg/mL；和/或，所述地高辛抗体选自地高辛的单克隆抗体，浓度为0.6～1.2mg/mL；和/或，所述二抗选自FITC抗体的羊抗鼠抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL。5.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板或塑料板；和/或，所述上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；和/或，所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；和/或，所述吸水区的材质包括滤纸。6.权利要求3-5中任一项所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其特征在于包括：将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于具体包括：使包含乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：张超，陈伟，陈奉玲，秦盼柱，
申请(专利权)人：安徽深蓝医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34