一种增强橡胶草抗除草剂的基因、介导载体及应用。本发明专利技术增强植物抗除草剂性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；含有本发明专利技术增强橡胶草抗除草剂基因的介导载体以及其在橡胶草遗传改良中的应用。本发明专利技术增强橡胶草抗除草剂性的基因用于在橡胶草遗传转化中，转化后橡胶草抗除草剂性能提高。
【技术实现步骤摘要】
一种增强橡胶草抗除草剂的基因、介导载体及应用
本专利技术涉及一种基因、介导载体及应用。
技术介绍
橡胶是重要的工业原料和战略物资，橡胶草虽然是一种天然的产胶植物，其产量无法与巴西胶树相比，无法满足工业需求，难以引起重视，20世纪中期，由于橡胶原料奇缺，曾引起苏联、美国、中国等对其形态结构、栽培技术及组织生理等方面进行研究，但分子生物学方面的研究较少。
技术实现思路
本专利技术提供了一种增强橡胶草抗除草剂的基因、介导载体及应用。本专利技术增强橡胶草抗除草剂基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。含有上述的增强橡胶草抗除草剂基因的介导载体。其中介导载体为农杆菌。上述增强橡胶草抗除草剂的基因用于橡胶草的遗传改良。橡胶草属于匍匐生长，根部含有橡胶，普通的机械除草方式，会伤害到橡胶草根和叶子的生长，本专利技术的基因用于在橡胶草遗传转化中，其在芽上表达的更强烈，转化后橡胶草的抗除草剂性能好，除掉杂草的同时，不影响橡胶草的生长，利于根部橡胶的积累。附图说明图1是冻融法转化农杆菌中提取的DNA的结果图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式增强橡胶草抗除草剂基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本实施方式基因的提取方法如下：1、增强橡胶草抗除草剂基因总DNA的提取：(1)取5～20mL的CTAB提取缓冲液，68℃预热，其中CTAB提取缓冲液：2％CTAB、100mmol/LTris-Cl、20mmol/LEDTA、1.4mol/LNaCl、2％体积的巯基乙醇，pH8.0；(2)取0.5g发根农杆菌(AgrobacteriumRhizogenes,R1601)用液氮研成粉末，尽量研细，转移至Eppendorf管中，加入700μL预热的CTAB提取缓冲液，剧烈振荡混匀；(3)加50μL的20％SDS，50μL的10％PVP和20μL的巯基乙醇，轻轻颠倒混匀，置于68℃水浴锅中30min；(4)加入300μLCI抽提一次，12000rpm离心5min；(5)取上清，加入300μLCI再抽提一次，12000rpm离心5min；(6)取上清，加入等体积的异丙醇，4℃冰浴沉淀20～30min；(7)12000rpm离心5min，去上清，沉淀加600μL70％乙醇洗涤；(8)8000rpm离心5min，去上清，沉淀置室温下待乙醇完全挥发；(9)加入30～50μL双蒸水溶解沉淀，保存于-20℃。2、增强橡胶草抗除草剂基因的克隆以增强橡胶草抗除草剂基因的总DNA为模板，利用特异性引物，在设计引物时加上XbaI和SmaI两个酶切位点，其中特异性引物为：EPSPS-1：5'-ACGTCTAGAATGAACAGGACCATGGCTCCATTG-3'XbaIEPSPS-2：5'-CCCGGGTTACTTCCTGGCGAGACA-3’SmaIPCR反应体系(总体积20μL)：PCR反应条件：PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测3、增强橡胶草抗除草剂基因的单克隆测序将克隆到的PCR产物与pMD18-Tvector克隆载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α。挑选片段扩增在1.5kb左右的单克隆，送交三博远志测序。连接体系(总体积7μL)：具体实施方式二：本实施方式含有具体实施方式一的增强橡胶草抗除草剂基因的介导载体。本实施方式的介导载体为农杆菌LBA4404。具体实施方式三：如具体实施方式一所述的增强橡胶草抗除草剂的基因用于橡胶草的遗传改良。实施例1：本专利技术的增强橡胶草抗除草剂的基因在橡胶草遗传转化中的应用，具体方法如下：一、基因表达到农杆菌中：(一)大肠杆菌感受态的制备E.coli感受态细胞制备(CaCl2法)。(1)挑取大肠杆菌DH5α单菌落，于10mLLB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h；(2)按1％接种量接种于60mLLB液体培养基中，37℃，180rpm培养2～2.5h，至OD600＝0.3～0.5；(3)菌液冰浴15～25min，分装于1.5mL无菌eppendorf管中，4℃，5000rpm离心5min；(4)弃上清，细胞悬垂于800μL冰预冷的0.1MCaCl2中，置冰上20～30min；(5)4℃，5000rpm离心5min，回收细胞；(6)加入100μL冰预冷的0.1MCaCl2重悬细胞；(7)分装，4℃保存12～24h，或-70℃保存备用。CaCl2的配制：无水CaCl20.66g、PIES0.3g、甘油15mL、加水定容至100mL、用NaOH调PH直至7.0，高压灭菌，于4℃冰箱保存备用。(二)大肠杆菌的转化(1)取大肠杆菌感受态细胞于冰上化冻15min；(2)加入增强植物抗除草剂的基因(1～2μL)，轻打混匀，冰浴30min；(3)42℃水浴箱热激60～90s；(4)迅速取出置于冰上2min；(5)加入1mLLB液体培养基，37℃培养1h；(6)5000rpm离心3min，留下适量上清，并将沉淀振开混匀，将约100μL菌液转移到附加Sm、Rif和Kan的LB固体培养基的平板上；其中附加Sm、Rif和Kan的LB固体培养基中链霉素：Streptomycin，Sm，其使用浓度为50mg/L；利福平：Rifampicin，Rif，其使用浓度为50mg/L；卡那霉素：Kanamycin，Kan，其使用浓度为100mg/L。(7)37℃恒温箱培养10～12h，挑取抗性白斑；(8)摇菌后进行PCR扩增鉴定分析。(三)重组质粒的鉴定(1)PCR检测：挑取单菌落于含抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，采用碱裂解法快速提取质粒DNA，以此质粒做为模板，用特异性引物进行PCR扩增反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测是否有所要的目的条带，初步确定重组子连接成功；特异性引物：EPSPS-1：5'-ACGTCTAGAATGAACAGGACCATGGCTCCATTG-3'XbaIEPSPS-2：5'-CCCGGGTTACTTCCTGGCGAGACA-3’SmaI(2)酶切检测：挑取限制性内切酶进行酶切反应，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带大小，从而确定外源片段是否插入以及插入片段的大小是否正确，进而判断重组克隆成功与否。(四)农杆菌感受态细胞的制备及转化(1)农杆菌(LBA4404)感受态细胞的制备1)从含有50mg/LSm、50mg/LRif的YEB的平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落；2)接种于5mL含有Sm、Rif的YEB液体培养基中，28℃，180rpm，振荡培养1～2d；YEB液体培养基中Sm的浓度为50mg/L、Rif的的浓度为50mg/L。3)取菌液按1：10的比例重新接种于50mL的含Sm、Rif的YEB液体培养基中；4)振荡培养6-8h，至对数生长期OD600≈0.5；5)菌液置于冰上20～30min，分装于高压灭菌的1.5mLeppendorf管中；6)4℃，5000rpm离心10min，弃上清；7)沉淀加入800μL冰预冷的0.05MCaCl2悬浮细胞，冰浴20～30min；8)4℃，5000rpm离心10min，弃上清；9)沉淀加入100μL冰预冷的0.05MCaCl2重悬细胞；10)置于4℃保存备用。(2)冻融法转化农杆菌LBA4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种增强橡胶草抗除草剂的基因，其特征在于增强橡胶草抗除草剂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种增强橡胶草抗除草剂的基因，其特征在于增强橡胶草抗除草剂基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.含有权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖宇，曾祥俊，孙力，
申请(专利权)人：肖宇，黑龙江瓦维洛佳科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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