水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用。本发明专利技术所提供的启动子pSSP5是下述任一：a)SEQ ID No.1；b)SEQ ID No.1的第1‑3799位；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具启动子功能；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能。实验证明，pSSP5启动子能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中特异表达。本发明专利技术对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

【技术实现步骤摘要】
水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及水稻雄蕊特异表达的启动子pSSP5及其应用。
技术介绍
对于中国这样的人口大国而言，粮食安全是社会稳定和可持续发展不可或缺的保障。随着中国经济的高速发展，城镇化过程不可避免地不断蚕食耕地面积。土地是农业之本，在土地面积不断减少、人口不断增加、人们对粮食的需求水平不断提高的压力下，保障粮食安全的唯一出路，只能是通过对植物生命活动的持续深入的研究，进行更加有效的作物改良，提高单位面积产量。经验表明，利用杂种优势进行育种是一个行之有效的作物改良方法，不仅能有效地利用杂种优势提高产量，还能通过各种不同的组合筛选，实现综合性状(包括品质和抗性)的快速组合，是大规模种业生产上行之有效的策略。在生产上大规模利用杂种优势的前提是雄性不育系。在传统的杂种优势利用中，人们利用自然变异筛选所获得的雄性不育系曾经成功地实现了大规模提高水稻产量的目标。可是，当杂种优势利用面对综合性状组合和种业的产业化运作时，缺乏具有自主知识产权的多元化雄性不育系就成为杂种优势利用的一个现实的、无法回避的严重技术制约。近年，通过对水稻的大规模突变体研究，人们发现了一批新的、可以造成雄性不育的基因，为创制多元化雄性不育系提供了新的选择。目前所报道的影响雄蕊发育的基因大多在减数分裂之后发挥作用，从植物器官形成和营养物质分配的角度而言，在雄蕊发育早期调控入手创制雄性不育系，将不仅能实现更加稳定的不育效果(彻底抑制雄蕊的形成)，而且还可以减少雄蕊早期发育过程(包括减数分裂)的消耗，让同样的光合产物进行更有效的利用。在1990年代初，植物花器官特征决定基因(ABC基因)的发现，证明器官特征决定可以由少数基因控制。本专利技术的专利技术人在前期工作中也曾成功地利用ABC基因中的B类基因AP3的启动子特异性地改变雄蕊中乙烯信号组分的表达，实现抑制雄蕊早期发育、在拟南芥中实现单性花的目的。迄今为止，尚未见在水稻雄蕊发育早期特异性表达的启动子的报道。显然，要有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权，当务之急就是要找到一批有效的、拥有自主知识产权的水稻雄蕊早期发育过程基因特异表达的调控元件，如启动子。基因表达的器官/组织/细胞特异启动子或调控元件(因为很多特异性调控元件并不在编码区上游，而在内含子中)的研究是分子生物学发展到1980年代时的一个研究热点。在植物中，欧洲科学家曾热衷于研究在根的各种组织中特异性表达启动子。随着对基因表达调控机制了解的不断深入和基因序列解析手段的发展，目前有关基因表达调控元件的分析也有了更加有效的方法。但由于分子生物学的发展的热点在启动子之后迅速转移到转录因子、染色质修饰、小RNA、大规模测序等新的热点，而植物分子生物学的研究在1990年代之后也将重点转移到突变体的筛选和相关基因分离上，有关器官/组织/细胞特异启动子或调控元件的研究在近年并没有成为大家关注的焦点。虽然这种局面的形成有其合理性，因为没有有功能的基因，也无从了解其表达的调控元件。随着模式植物和重要作物基因组测序的完成，特别是人类ENCODE计划的完成，基因表达的时空特异性精细调控必将成为人们关注的下一个焦点。而且从应用的角度出发，要利用生物技术改变基因表达，实现特定的产业化需求，必然要通过调控元件来控制基因表达的时空特异性。因此器官/组织/细胞特异性基因表达的调控元件的分离克隆和应用，必然成为分子生物学和生物技术研究的下一个无法回避的技术挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。本专利技术所提供的具有启动子功能的DNA分子，命名为pSSP5启动子，来源于水稻(Oryzasativa)，是下述a)-d)中任一的DNA片段：a)SEQIDNo.1所示DNA片段；b)SEQIDNo.1的第1-3799位所示DNA片段；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。其中，SEQIDNo.1共由3926个核苷酸组成，第3780-3926位为5’-UTR序列。含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本专利技术的一个实施例中，所述重组载体具体为将SEQIDNo.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1305.1载体的EcoRI和KpnI酶切位点间，且将pCAMBIA1305.1载体中的HindIII和NcoI酶切位点间的35S启动子缺失，且保持pCAMBIA1305.1载体的其他序列不变得到的载体。所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本专利技术的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1305.1载体)。所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。进一步地，所述表达为雄蕊特异性表达。进一步地，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。更进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。更加具体地，所述禾本科植物可为水稻，如水稻品种中花11。实验证明，本专利技术所提供的pSSP5启动子，能够有效启动目的基因在水稻雄蕊中的特异性表达。本专利技术对于有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。附图说明图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-5为PCR产物；M为marker。图2为pCAMBIA1305.1载体的结构图。图3为PCR鉴定pSSP5:GUS载体的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-24为构建的载体；M为marker。图4为PCR鉴定转pSSP5:GUS植株琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-23为转pSSP5:GUS植株；24为野生型阴性对照；M为marker。图5为转pSSP5:GUS植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。标尺为1mm。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的pCAMBIA1305.1载体是CAMBIA公司的产品。下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mMPBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mM亚铁氰化钾、100mM铁氰化钾、0.5mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA分子，是下述a)‑d)中任一的DNA片段：a)SEQ ID No.1所示DNA片段；b)SEQ ID No.1的第1‑3799位所示DNA片段；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.DNA分子，是下述a)-d)中任一的DNA片段：a)SEQIDNo.1所示DNA片段；b)SEQIDNo.1的第1-3799位所示DNA片段；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东辉，叶思达，白书农，许智宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11