一种辣椒离体再生方法及所用的培养基技术

本发明专利技术涉及一种适于辣椒离体再生方法及其所用的培养基，其是以辣椒无菌苗带柄子叶为外植体，再生芽诱导培养基激素配方为3.0‑9.0 mg/L ZT＋5.0‑9.0 mg/L 6‑BA＋0.05 mg/L IAA，通过删减畸形玫瑰花瓣状叶状体而存留1‑2个正常不定芽，再生芽继代培养基的激素配方为5.0‑7.0 mg/L ZT＋7.0 mg/L 6‑BA＋0.05 mg/L IAA，生根的培养基激素配方为0.5‑0.7 mg/L IBA。该辣椒离体再生体系的建立为进一步建立辣椒遗传转化体系的建立奠定了坚实基础。

A method of in vitro regeneration of pepper and its medium

The present invention relates to a method suitable for in vitro regeneration of pepper and the medium used. The method is based on the cotyledon with petiole of aseptic seedling of pepper as explant, the hormone formula of regeneration bud induction medium is 3.0 9.0 mg/L ZT+5.0 9.0 mg/L 6 BA+0.05 mg/L IAA, and 1 2 normal adventitious buds are retained by deleting deformed Rose petal-shaped leaves, and hormone matching of regeneration bud subculture medium. The prescription was 5.0 7.0 mg/L ZT+7.0 mg/L 6 BA+0.05 mg/L IAA, and the formula of rooting medium hormone was 0.5 0.7 mg/L IBA. The establishment of in vitro regeneration system of Capsicum lays a solid foundation for further establishment of genetic transformation system of capsicum.

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒离体再生方法及所用的培养基
本专利技术属于植物组织培养领域，具体涉及辣椒的离体再生体系及其所用的培养基。
技术介绍
辣椒(CapsicumannuumL.)属茄科，是一种深受人们喜爱的重要的蔬菜作物和调味品，在世界范围内广泛栽培。由于生物和非生物胁迫，以及辣椒自身基因的易损性大大限制了辣椒的发展。以离体再生和遗传转化技术作为关键的植物生物技术，是当前弥补作物常规育种不足和促进作物育种进程的有效手段。自Gunay于1978年首次开展辣椒组培工作至今四十余年，相继有关于探索辣椒离体再生体系建立的文献报道。据统计，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的离体再生，是辣椒离体再生系统研究最多的一个领域，然而这些辣椒离体再生技术主要停留在芽诱导阶段，仍然存在芽难以伸长、生根困难等问题。在辣椒离体再生芽的诱导过程中，通常采用的培养基的激素配方为6-BA与IAA的配比，其诱导再生效率为90％以上。为了探索辣椒离体再生过程中不定芽的伸长，研究者们侧重于激素配比优化，认为GA是诱导不定芽伸长的一个重要因素。例如中国专利文献CN109258469A，所用的不定芽诱导培养基为MS+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA，芽伸长培养基在不定芽诱导培养基的基础上添加GA3这一激素；在中国专利文献CN108338073A中的芽伸长诱导培养也同样采用了添加GA3。然而，GA诱导辣椒离体再生不定芽伸长的效果并不如意，芽的伸长效率低，且存在基因型依赖等问题。另外，杨博智等(分子植物育种，2018年，第16卷，第4期，第1244-1249页)报道用6-BA浸泡预处理辣椒子叶外植体，获得最佳不定芽诱导培养基为MS+4.0mg/L6-BA和最佳不定芽伸长培养基为MS+6.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA，其重点似乎是在浸泡预处理，激素配方并不理想，芽伸长效率仅为23.21％。到目前为止，辣椒通过组织培养获得再生体系的技术一直未得到突破，利用DNA重组技术进行辣椒遗传转化的进展也非常缓慢。有研究者在辣椒中尝试了一些遗传转化方法，如以胚性愈伤、原胚和成熟体细胞胚等为受体进行遗传转化、或者利用原生质体融合、花粉管及基因枪转化法等方法，或者直接进行改良的水培育苗+外界环境下农杆菌介导获取辣椒转化苗，但这些方法存在转化效率低、再生频率低、周期长、不定芽伸长困难、或者实验成本高、操作相对复杂等问题。建立高效的离体再生和遗传转化体系，是作物利用基因工程技术进行有效的遗传改良基础。然而，辣椒的离体再生体系建立一直未获得重大突破，从而限制了辣椒遗传转化体系的建立和基因工程在辣椒遗传改良上的应用，亟待建立高效、稳定的辣椒离体再生体系。
技术实现思路
本专利技术首先提供一种辣椒外植体诱导分化不定芽的方法，以辣椒无菌苗带柄子叶为外植体，再生芽诱导分化培养基激素配方为3.0-9.0mg/LZT+5.0-9.0mg/L6-BA+0.04-0.06mg/LIAA。已处于分化状态的辣椒子叶回复到分裂状态并开始快速的分裂分化需要适宜的外源激素，细胞分裂素和生长素搭配对芽的分化具有促进作用。本专利技术人在研发时无意中发现ZT和6-BA的浓度在相对较高的情况下，效果更佳，生长素IAA与细胞分裂素6-BA和/或ZT搭配可100％诱导子叶再生形成叶状体。但叶状体的状态与细胞分裂素的类型及其浓度密切相关：6-BA主要诱导离体子叶叶柄端切口玫瑰花瓣状叶状体形成，ZT诱导再生的叶状体包括玫瑰花瓣状和长条形，而切口端愈伤组织的形成与6-BA密切相关。愈伤组织的快速生长有利于从培养基中获得包括植物激素在内的营养物质供给叶状体的生长。因此在深入研究和大量实验的基础上，在IAA浓度合适的情况下，3.0-9.0mg/LZT和5.0-9.0mg/L6-BA组合均能使子叶离体再生许多的叶状体，大部分叶状体呈玫瑰花瓣状，少部分呈长条形，且叶状体生长快，因此该浓度组合适宜于子叶离体再生的诱导。在一个实施方式中，再生芽诱导分化培养基以MB为基本培养基，优选地ZT的浓度为5.0-7.0mg/LZT，6-BA浓度为6.0-8.0mg/L，IAA浓度为0.05mg/L.因而，本专利技术也提供用于上述诱导分化的再生诱导分化培养基。进一步，再生芽诱导分化过程无菌苗的获得是常规的方法，例如挑选健康无病菌的辣椒新鲜种子(当年收获)，用纯净水浸种48h后进行消毒，如先用75％酒精消毒60s，然后用0.1％HgCl2消毒10min，接着用无菌水冲洗4次，2min/次，最后将种子接种于添加3％蔗糖和0.5％琼脂粉的MB培养基(MS大量元素+MS微量元素+MS铁盐+B5有机成分，pH＝5.8)，光照培养(温度：25±2℃，光强：2500Lx，光周期：14h光照/10h黑暗)，约7d后种子开始萌发形成无菌苗。其中外植体为带柄子叶，更具体是将辣椒无菌苗的子叶从叶柄端切下获得，优选地带有0.1-0.2cm长的叶柄，在近叶尖1-2cm处切除叶尖。再生芽诱导分化培养的具体步骤是先经过暗培养，再进行光培养，优选地是暗培养5d至30d，更优选地暗培养10d至25d，最优选暗培养21d；光培养条件为温度：25±2℃，光强：2500Lx，光周期：14h光照/10h黑暗。培养时最好将子叶外植体腹面朝上和背面朝下接种于再生芽诱导分化培养基上。不定芽的伸长也是辣椒离体再生成苗的关键环节之一。虽然可以采用常规的方法进行，但为了达到更好的效果，本专利技术人研发了一种删减再生芽数量并配合激素方案获得很好的再生芽伸长的效果，构成本专利技术的另外一个方面。将畸形的玫瑰花瓣状叶状体切除，留1-2个叶片呈对生的长条形的正常不定芽，进行继代培养，继代培养激素配方为0.04-0.06mg/LIAA，3.0-7.0mg/LZT与5.0-9.0mg/L6-BA组合，其中IAA优选浓度为0.05mg/L，ZT优选浓度为5.0-7.0mg/L，更优选为6.0mg/L，6-BA优选浓度为6.0-8.0mg/L，更优选为7.0mg/L。进一步地，继代培养基以MB为基本培养基，pH5.8。因此，本专利技术还提供一种外植体上不定芽伸长的继代培养方法。所述方法是基于本专利技术人发现辣椒离体子叶在再生分化培养基上诱导再生形成的叶状体数量多且大部分为畸形的玫瑰花瓣状，少数为长条形，它们在分化培养基上继续生长未见茎的伸长。而现有研究认为在不定芽伸长阶段添加GA3是必需的。本专利技术经试验结果显示，GA3对不同状态叶状体的茎伸长的影响存在差异：GA3对离体子叶再生形成的数量少呈长条形对生的叶状体的茎伸长具有明显的促进作用，对玫瑰花瓣状叶状体及非对生状叶状体的茎伸长的作用不明显。适宜的GA3浓度为1.0-2.0mg/L，GA3浓度为3.0mg/L时易使叶状体呈水渍状。此外，GA3使叶状体黄化变薄，即使诱导再生芽的茎伸长了，也难以生根。因为，辣椒离体子叶再生不定芽的生根与不定芽的状态密切相关。经GA3诱导伸长的不定芽纤瘦、叶黄化变薄，生根困难，而通过删减叶状体的方法诱导茎伸长的不定芽健壮、叶碧绿，极易生根。而采用本专利技术中的继代培养方法，发现进行继代培养，2周后再生芽明显伸长，叶片碧绿呈长椭圆形，茎粗壮。继代培养基中不同浓度配比的ZT和6-BA对不定芽伸长的影响方面可以看出：1.0mg/LZT与1.0-9.0mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种辣椒子叶外植体诱导分化方法，其特征在于，以辣椒无菌苗带柄子叶作为外植体，再生芽诱导分化培养基的激素配方为3.0‑9.0 mg/L ZT＋5.0‑9.0 mg/L 6‑BA＋0.04‑0.06 mg/L IAA，优选采用MB为基本培养基；进一步优选地先经过暗培养，再进行光培养，优选地是暗培养5d至30天，更优选地暗培养10 d至25 d，最优选暗培养21 d；光培养优选条件为温度：25±2℃，光强：2500 Lx，光周期：14 h光照/10 h黑暗。

【技术特征摘要】
1.一种辣椒子叶外植体诱导分化方法，其特征在于，以辣椒无菌苗带柄子叶作为外植体，再生芽诱导分化培养基的激素配方为3.0-9.0mg/LZT＋5.0-9.0mg/L6-BA＋0.04-0.06mg/LIAA，优选采用MB为基本培养基；进一步优选地先经过暗培养，再进行光培养，优选地是暗培养5d至30天，更优选地暗培养10d至25d，最优选暗培养21d；光培养优选条件为温度：25±2℃，光强：2500Lx，光周期：14h光照/10h黑暗。2.如权利要求1所述的辣椒子叶外植体诱导分化方法，其特征在于，ZT的浓度为5.0-7.0mg/LZT，6-BA浓度为6.0-8.0mg/L，IAA浓度为0.05mg/L。3.如权利要求1所述的辣椒子叶外植体诱导分化方法，其特征在于，所述带柄子叶外植体带有0.1-0.2cm长的叶柄，在近叶尖1-2cm处切除叶尖.培养时将子叶外植体腹面朝上和背面朝下接种于再生芽诱导分化培养基上。4.一种辣椒子叶外植体诱导分化的不定芽伸长的方法，其特征在于，对已分化的每个外植体删减其再生芽数量至1-2个叶片呈对生的长条形的不定芽，进行继代培养，所述继代培养基的激素配方为0.04-0.06mg/LIAA，3.0-7.0mg/LZT与5.0-9.0mg/L6-BA组合，其中IAA优选浓度为0.05mg/L，ZT优选浓度为5.0-7.0mg/L，更优选为6.0mg/L，6-BA的优选浓度为6.0-8.0mg/L，最优选为7.0mg/L；进一步地，继代培养基以MB为基本培养基，pH5.8。5.一种辣椒子离体再生的方法，以带柄子叶作为外植体，其特征在于，诱导分...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱义兰，刘如石，邓双，杜婧婧，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43