检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组，该特异性引物组包括针对恶性疟原虫k13基因的四个抗性突变位点设计的四对特异性引物；上述四对特异性引物在进行PCR扩增实际上是将多对特有异性引物的扩增转化为一对通用引物的扩增，使得各模板的扩增效率趋于一致，而不影响各特有异性引物的扩增效率，从而达到真正的高通量检测鉴别多种病原体的目的，且上述四对特异性引物在进行PCR扩增后得到的PCR产物的大小具有明显的区别，用于准确判定突变位点。

Detection of K13 gene mutation site of Plasmodium falciparum by specific primers and its application

The invention discloses a specific primer group for detecting mutation sites of K13 gene of Plasmodium falciparum, which includes four pairs of specific primers designed for four resistance mutation sites of K13 gene of Plasmodium falciparum. The four pairs of specific primers are actually amplified by transforming the amplification of multiple pairs of specific primers into the amplification of a pair of universal primers to make the amplification anisotropic. The amplification efficiency of template tends to be consistent without affecting the amplification efficiency of specific primers, so as to achieve the purpose of real high-throughput detection and identification of multiple pathogens, and the size of PCR products obtained by the above four pairs of specific primers after PCR amplification has obvious differences, which can be used to accurately determine mutation sites.

【技术实现步骤摘要】
检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用
本专利技术属于恶性疟原虫青蒿素耐药基因检测
，具体涉及一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组及其应用。
技术介绍
近年来，随着中国国际贸易、劳务输出的日趋频繁，境外输入性疟疾也明显增多。耐药性恶性疟原虫在全球广泛分布，对人类健康造成严重的危害。检测输入性恶性疟原虫的相关突变基因，可以有效的对输入性恶性疟原虫的抗药性进行早期检测，以便及时控制恶性疟原虫的传播速度和及时调整用药方案，延缓疟原虫抗性的产生，延长抗疟药物的使用时间，对消除恶性疟原虫的的工作具有重要的意义。世界范围内恶性疟原虫对传统抗疟药产生普遍的抗药性，已成为阻碍全球疟疾消除进程的重要因素[1]。近几年来，在东南亚地区发现青蒿素抗药性恶性疟原虫也为青蒿素类药物的使用带来了潜在的威胁[2]。最新研究发现，恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(K13-propellergene，k13)上位点的突变与恶性疟原虫对青蒿素抗性的产生紧密相关[3]。此后Talundzic等[4]、Tun等[5]和Wang等[6]分别发现泰国、缅甸以及中缅边境流行的恶性疟原虫株的K13基因多个位点发生突变。Feng等[7]对广西境外务工回国人员感染的恶性疟原虫的研究发现，K13基因所有突变位点中C580Y突变率最高(2.7％)。当K13基因某些位点发生突变，会削弱K13-propeller蛋白与受体蛋白的相互作用，导致青蒿素耐药性的发生[3]因此，以检测K13基因kelch结构域多态来预测恶性疟原虫青蒿素耐药性具有理论支撑。多重PCR和多重荧光PCR是两种在多种病原混合感染中应用较多的检测鉴别技术。多重PCR需多对特异性引物组合在一个反应体系中同时竞争地结合扩增，引物之间会产生干扰，每多增加一对引物，其形成复杂引物二聚体的概率大大增加，敏感性就越低，加之多重PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，难以区分小于100bp的条带；而多重荧光PCR由于探针要标记不同波长的荧光基团，如标记越多，相互会产生干扰越大，敏感性就越低。多重PCR和多重荧光PCR检测的目的基因数量有限，一般只能进行2至4重的检测，都达不到真正的高通量快速检测和分析多种病原体的目的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：多重PCR和多重荧光PCR检测的目的基因数量有限，一般只能进行2至4重的检测，都达不到真正的高通量快速检测和分析多种病原体的目的。本专利技术提供一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组。本专利技术的技术方案如下：一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组，该特异性引物组包括针对恶性疟原虫k13基因的四个抗性突变位点设计的四对特异性引物；其中，四个抗性突变位点分别为：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；四对特异性引物分别为：Y493H特异性引物、R539T特异性引物、I543T特异性引物以及C580Y特异性引物；其中，Y493H特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTACAC，Y493H特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTTGACGTAACACCACAATTATTTCTTCTAG；R539T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATAATTGTGGTGTTACGTCAAATGGTACA；R539T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGATACATTCGGTATAATAGAAGAGCCATCATA；I543T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGTGTTACGTCAAATGGTAGAATTTATTGTACT；I543T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGACTCTCACCATTAGTTCCACCAATGAC；C580Y特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGT；C580Y特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTATATAAGAATCTGACAATGTGGCAGCT。本专利技术的工作原理或有益效果为：上述四对特异性引物在进行PCR扩增实际上是将多对特有异性引物的扩增转化为一对通用引物的扩增，使得各模板的扩增效率趋于一致，而不影响各特有异性引物的扩增效率，从而达到真正的高通量检测鉴别多种病原体的目的，且上述四对特异性引物在进行PCR扩增后得到的PCR产物的大小具有明显的区别，用于准确判定突变位点。进一步限定，所述Y493H的特异扩增片段大小为200bp；所述R539T的特异扩增片段大小为113bp；所述I543T的特异扩增片段大小为232bp；所述C580Y的特异扩增片段大小为374bp。本专利技术还提供一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组的应用，该特异性引物组可作为确定GeXP多重PCR方法的检测浓度的下限、检测的灵敏度、检测的特异性以及诊断效能的应用。附图说明图1为R539T特异性引物的PCR反应产物电泳图；图2为I543T特异性引物的PCR反应产物电泳图；图3为C580Y特异性引物的PCR反应产物电泳图；图4为Y493H特异性引物的PCR反应产物电泳图；图5为四对特异性引物的PCR反应产物电泳图；图6为R539T特异性引物的GeXP单重PCR检测结果；图7为Y493H特异性引物的GeXP单重PCR检测结果；图8为I543T特异性引物的GeXP单重PCR检测结果；图9为C580Y特异性引物的GeXP单重PCR检测结果；图10为C580Y特异性引物和R539T特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果；图11为R539T特异性引物和Y493H特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果；图12为R539T特异性引物和I543T特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果；图13为C580Y特异性引物、R539T特异性引物以及Y493H特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果；图14为I543T特异性引物、R539T特异性引物以及Y493H特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果；图15为I543T特异性引物、R539T特异性引物、Y493H特异性引物以及C580Y特异性引物的混合物的GeXP多重PCR检测结果。具体实施方式下面采用具体实施方式进行说明。本专利技术的实施方式包括但不限于下列实施例。实施例11)设计特异性引物组参考文献和NCBI数据库，搜索近8年恶性疟原虫耐青蒿素分子标记k13基因序列及其四个SNP位点，并从GenBank数据库中下载蛋白和核苷酸序列，使用Clustalx软件进行多序列同源性比对分析，将比对结果输入GeXPeXpressProfiler工具设计四对特异性引物。四对特异性引物使用NCBIPrimer-Blast,PrimerPremier5.0和Oligo6.0软件进行分析筛选。同时下载近缘的间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、三日疟原虫(Plamodiummalariae)系列，进行同源干扰评估。样本收集和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组，其特征在于，该特异性引物组包括针对恶性疟原虫k13基因的四个抗性突变位点设计的四对特异性引物；其中，四个抗性突变位点分别为：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；四对特异性引物分别为：Y493H特异性引物、R539T特异性引物、I543T特异性引物以及C580Y特异性引物；其中，Y493H特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTACAC，Y493H特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTTGACGTAACACCACAATTATTTCTTCTAG；R539T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATAATTGTGGTGTTACGTCAAATGGTACA；R539T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGATACATTCGGTATAATAGAAGAGCCATCATA；I543T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGTGTTACGTCAAATGGTAGAATTTATTGTACT；I543T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGACTCTCACCATTAGTTCCACCAATGAC；C580Y特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGT；C580Y特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTATATAAGAATCTGACAATGTGGCAGCT。...

【技术特征摘要】
1.一种检测恶性疟原虫k13基因突变位点的特异性引物组，其特征在于，该特异性引物组包括针对恶性疟原虫k13基因的四个抗性突变位点设计的四对特异性引物；其中，四个抗性突变位点分别为：Y493H、R539T、I543T以及C580Y；四对特异性引物分别为：Y493H特异性引物、R539T特异性引物、I543T特异性引物以及C580Y特异性引物；其中，Y493H特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATGGAAGTGCTGTATTGAATAATTTCTTACAC，Y493H特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGAATTTGACGTAACACCACAATTATTTCTTCTAG；R539T特异性引物的正向引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATAATTGTGGTGTTACGTCAAATGGTACA；R539T特异性引物的反向引物序列为：GTACGACTCACTATAGGGATACATTCGGTATAATAGAAGAGCCATCATA；I543T特异性引物的正向引物序列为：AGGTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：石莹，王俊贤，田绿波，樊学军，
申请(专利权)人：四川国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：四川,51