聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体。具体地，本发明专利技术涉及多种改善热稳定性及酶活的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体，其包括一个或多个特定氨基酸残基的取代。变体还可选择地包括在其它位点的额外改变。

Polyphosphate Dependent Glucokinase Variant and Its Application

The present invention relates to polyphosphate-dependent glucokinase variants. Specifically, the present invention relates to a variety of polyphosphate-dependent glucokinase variants that improve thermal stability and enzyme activity, including the substitution of one or more specific amino acid residues. Variants can also optionally include additional changes at other loci.

【技术实现步骤摘要】
聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase)变体、其制备方法及应用，编码变体的DNA分子、载体、宿主细胞。
技术介绍
聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase)简称PPGK，可以利用无机聚磷酸作为磷酸供体催化葡萄糖形成葡萄糖6-磷酸。无机聚磷酸(Pi)n为多个磷酸残基通过磷酸酐键连接而成的直链聚合物，相对于ATP，无机聚磷酸具有一系列优点，比如价格低廉，热稳定性好，对pH的耐受力强，耐氧化剂等。产物葡萄糖6-磷酸可以作为很多高值生化成品的合成前体，比如甜菊糖、人参皂苷、果糖1,6-二磷酸，肌醇等。在医疗领域，葡萄糖激酶还可用于血糖的定量测定。目前已有多个不同来源的PPGK被发现，不过这些所知的PPGK大多数为常温菌来源，目前唯一已知的来源于嗜热菌褐色嗜热裂孢菌Thermobifidafusca的PPGK热稳定性较差，游离酶在50℃下的半衰期(t1/2)只有15min(Liaoetal.,2012)。目前尚没有关于PPGK热稳定性改造方面的研究，PPGK较差的热稳定性不仅限制了其应用范围，而且酶易于失活，增加了生产成本，因此亟需获取热稳定性得到改善的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体用于非ATP依赖的葡萄糖6-磷酸及其衍生物的生产。
技术实现思路
本专利技术针对目前已知的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶热稳定性差的问题，提供了多个聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体及其制备方法，所提供的变体热稳定性、半衰期均有所提高，从而可以延长酶的使用寿命，降低酶的生产成本，具有广阔的工业应用前景。第一，本专利技术提供了多种聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体。本专利技术所提供的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体与亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶相比热稳定性提高，变性温度较亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶提高1-20℃，优选地，提高10-20℃，更优选地，提高15-20℃。所述聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体包括至少一个相应于褐色嗜热裂孢菌菌株YX来源的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶在位点F30、R34、T72、V88、A231上氨基酸残基的取代。优选地，该变体在位点F30、R34、T72、V88、A231上氨基酸残基的取代分别为F30L、R34P、T72A、V88M、A231T。更优选地，该变体的氨基酸残基取代包括如下组合a)或b)或c)：a)F30L+T72A+A231T；b)F30L+T72A+V88M+A231T；c)F30L+R34P+T72A+V88M+A231T。优选地，亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶选自下述序列特征a)或b)：a)来源于放线菌，具体为褐色嗜热裂孢菌，更具体为褐色嗜热裂孢菌菌株YX所示氨基酸序列SEQIDNO:1；b)具有与SEQIDNO:1所示氨基酸序列至少50％同源性，特别是至少70％同源性，更特别是至少80％同源性的氨基酸序列。第二，本专利技术提供了一种聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体的制备方法。采用本专利技术所提供的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体的制备方法，获得的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体与亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶相比热稳定性提高，变性温度较亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶提高1-20℃，优选地，提高10-20℃，更优选地，提高15-20℃。具体包括以下步骤：a)选择亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶；b)改造a)步骤选定的亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的编码序列，使其编码序列在相应于褐色嗜热裂孢菌菌株YX来源的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶位点F30和/或R34和/或T72和/或V88和/或A231处发生氨基酸残基取代。c)选择变性温度较亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶提高1-20℃的变体，优选提高10-20℃的变体，更优选提高15-20℃的变体。优选地，所述位点F30、R34、T72、V88、A231的氨基酸的取代分别为F30L、R34P、T72A、V88M、A231T。更优选地，所述氨基酸的取代包括如下组合a)或b)或c)：a)F30L+T72A+A231T；b)F30L+T72A+V88M+A231T；c)F30L+R34P+T72A+V88M+A231T。优选地，所述亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶具有下述序列特征a)或b)：a)来源于放线菌，具体为褐色嗜热裂孢菌，更具体为褐色嗜热裂孢菌菌株YX所示氨基酸序列SEQIDNO:1；b)具有与SEQIDNO:1所示氨基酸序列至少50％同源性，特别是至少70％同源性，更特别是至少80％同源性的氨基酸序列。第三，本专利技术提供了第一方面所述聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体的编码基因以及含该编码基因的表达载体或宿主细胞。第四，本专利技术提供了聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体在生产葡萄糖6-磷酸以及葡萄糖6-磷酸的衍生物中的应用。以葡萄糖和聚磷酸为底物，采用本专利技术的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体，再偶联肌醇-3-磷酸合成酶(Inositol-3-phophatesynthase，EC5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(Inositolmonophosphatase，EC3.1.3.25)，配制多酶反应体系，在70℃生产肌醇。本专利技术所涉及到的术语及定义聚磷酸依赖型葡萄糖激酶亲代酶是根据酶命名法被分类为EC2.7.1.63的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶。它是一种来源于细菌的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶，诸如放线菌聚磷酸依赖型葡萄糖激酶。具体为褐色嗜热裂孢菌，更具体为褐色嗜热裂孢菌菌株YX。SEQIDNO:1显示了褐色嗜热裂孢菌菌株YX的聚磷酸依赖型葡萄糖激酶氨基酸序列(成熟肽)。氨基酸和其改变的命名法说明书与权利要求书中在提到氨基酸时使用它们的单字母缩写代码。序列中特定的氨基酸用其单字母编码和其位置来确定，例如F30表示Phe(苯丙氨酸在位置30)。本文用来定义取代的命名法如下所示，例如F30L表示在位点30用L(Leu)来取代F(Phe)。同源性与序列对比两个氨基酸序列之间的相关性用参数“同源性(同一性)”来描述。就本专利技术而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)的Needle程序版本2.8.0确定的。Needle程序执行在Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开放罚分是10，并且缺口延伸罚分是0.5。本专利技术的氨基酸序列(“专利技术序列”)和权利要求中涉及的氨基酸序列(例如SEQIDNO:1)之间的同源性程度，是通过两个序列比对中精确匹配的数目，除以“专利技术序列”的长度或SEQIDNO:1的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。当“专利技术序列”和SEQIDNO:1在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用“|”代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQIDNO:1的氨基酸1-263的长度是263)。在以下的纯假设性比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口用“-”表示。假设性比对实例：序列1：HTWGER-NLACMS||本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体，其特征在于，所述变体包括至少一个相应于褐色嗜热裂孢菌菌株YX的亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶中的位点F30、R34、T72、V88、A231的氨基酸残基的取代。

【技术特征摘要】
1.一种聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体，其特征在于，所述变体包括至少一个相应于褐色嗜热裂孢菌菌株YX的亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶中的位点F30、R34、T72、V88、A231的氨基酸残基的取代。2.根据权利要求1所述的变体，其特征在于，所述变体在位点F30、R34、T72、V88、A231的氨基酸残基的取代分别为F30L、R34P、T72A、V88M、A231T。3.根据权利要求1或2所述的变体，其特征在于，所述变体的氨基酸残基取代包括如下组合：a)F30L+T72A+A231T；或b)F30L+T72A+V88M+A231T；或c)F30L+R34P+T72A+V88M+A231T。4.根据权利要求1-3任一所述的变体，其特征在于，所述亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶选自下述序列特征：a)来源于放线菌，具体为褐色嗜热裂孢菌，更具体为褐色嗜热裂孢菌菌株YX所示氨基酸序列SEQIDNO:1；或b)具有与SEQIDNO:1所示氨基酸序列至少50％同源性，特别是至少70％同源性，更特别是至少80％同源性的氨基酸序列。5.根据权利要求1-4所述的任一变体，其特征在于，所述变体的变性温度较亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶提高1-20℃；优选地，提高10-20℃；更优选地，提高15-20℃。6.一种聚磷酸依赖型葡萄糖激酶变体的制备方法，其中包括：a)选择亲代聚磷酸依赖型葡萄糖激酶；b)改造a)步骤选定的亲代聚磷酸依赖型...

【专利技术属性】
技术研发人员：张以恒，周伟，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12