靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST‑shRNA表达载体复合物及其应用。本发明专利技术要解决的技术问题是现有技术中没有有效的靶向肿瘤相关巨噬细胞的治疗手段。本发明专利技术解决上述技术问题的技术方案是提供一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST‑shRNA表达载体复合物，即装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。本发明专利技术GHOST‑shRNA表达载体复合物能够特异的、有效的、低毒性的干扰巨噬细胞中LAMP2a的表达，能够有效治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤，具有很好的应用前景。

GHOST-shRNA expression vector complex targeting tumor-associated macrophages and its application

The present invention relates to the field of cancer biotherapy, in particular to a GHOST shRNA expression vector complex targeting tumor-related macrophages and its application. The technical problem to be solved by the present invention is that there is no effective therapeutic method for targeting tumor-related macrophages in the prior art. The technical solution of the invention is to provide a GHOST shRNA expression vector complex targeting tumor-related macrophages, i.e. bacterial GHOST loaded with shRNA eukaryotic expression vector inhibiting LAMP2a expression. The GHOST shRNA expression vector complex of the invention can specifically, effectively and low toxicity interfere with the expression of LAMP2a in macrophages, and can effectively treat macrophage highly invasive tumors, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用
本专利技术涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用。
技术介绍
在肿瘤组织中浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞，其在多种肿瘤中浸润程度都很高，并在临床上与肿瘤的预后有直接关系。在乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中，肿瘤相关巨噬细胞浸润程度的高低与不良预后呈明显的正相关作用。在肿瘤的免疫疗法中，肿瘤相关巨噬细胞是有很高潜力的治疗靶点，有研究者发现针对CSF-1/CSF-1R通路的抑制剂在小鼠乳腺癌和宫颈癌模型中可以清除TAM，提高CD8+T细胞活性，从而抑制肿瘤生长；而在脑胶质瘤模型中，CSF-1/CSF-1R通路的抑制剂可以使肿瘤体积明显减小。此外，卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中，也有通过靶向肿瘤相关巨噬细胞来治疗肿瘤的方案报道。LAMP2a(lysosome-associatedmembraneproteintype2a)是分子伴侣自噬的靶蛋白溶酶体受体，同时也是分子伴侣自噬的关键效应蛋白。分子伴侣自噬相对于其他自噬的主要特点是选择性降解靶蛋白，不依赖于囊泡将靶蛋白输送至溶酶体内腔，并以此特异性的改变细胞进程，且不会引起细胞器损伤或细胞死亡。因此，LAMP2a在细胞生理行为中可以起到一种“特异性开关”的作用，即通过特异性降解某些激酶、核转录因子或蛋白抑制子等，来改变细胞的生理行为；并且能准确的识别某些损伤蛋白，而不影响其他正常蛋白的功能。目前，LAMP2a与分子伴侣自噬的研究热点集中于细胞衰老，神经退行性疾病及其在肿瘤细胞中的作用，而未将其作为肿瘤相关巨噬细胞中的治疗靶点。大肠杆菌GHOST是人工诱导的大肠杆菌空壳。通过在大肠杆菌中诱导肠道菌属噬菌体phiX174的溶解蛋白E的表达，可导致大肠杆菌的内外膜发生互溶并形成跨膜孔洞，由于内腔压力，细菌基质会被喷吐至胞外，只留下结构相对完整的外壳，即为GHOST。由于大肠杆菌细胞外壁主要成分为磷酸脂多糖，其中的磷酸基团带有负电荷；而内膜中富含的胺基则带有正电荷。这种内外膜电位的不同保证了负电性的DNA质粒只会结合在细菌内部，而非外部。在转染细胞时，这种细菌GHOSTs只会被具有吞噬功能的细胞摄取，而肿瘤微环境中的吞噬细胞主要为肿瘤相关巨噬细胞。在被细胞吞噬之后，大肠杆菌细胞膜中的磷脂酰乙醇胺会与吞噬小泡的囊膜发生互溶，以保证GHOST携带的部分DNA质粒从吞噬小泡的水解环境中逃离至细胞质中，完成外源基因的表达。溶解蛋白E所诱导的细菌内外膜互溶会破坏细菌外壁中脂多糖(LPS)的类脂A(lipidA)基团，影响LPS核心结构，降低GHOST的免疫原性；同时细菌内容物的逸散也会大大降低GHOST的免疫原性。这种细菌GHOST对巨噬细胞的毒性远低于常用的阳离子脂质体。因此，大肠杆菌GHOST可以特异、高效、安全的转染巨噬细胞。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是现有技术中没有有效的靶向肿瘤相关巨噬细胞的治疗手段。本专利技术解决上述技术问题的技术方案是提供一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物。该靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物为装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是能表达针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA序列。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的shRNA真核表达载体中的shRNA模板序列为SEQNo.1、SEQNo.2、SEQNo.3、SEQNo.4、SEQNo.5或SEQNo.6中的至少一条所示。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的shRNA真核表达载体为质粒载体。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的质粒载体为pENTR/U6、pLKO.1、pGPU6、pGPH1或pGenesil-2中的至少一种。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌、胸膜炎放线杆菌或溶血曼海姆菌中至少一种的GHOST。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST为大肠杆菌DH5α的GHOST。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST和shRNA真核表达载体之间的比例为：每108个大肠杆菌GHOST装载0.3～10μgshRNA真核表达载体。优选的，每108个大肠杆菌GHOST装载1～5μgshRNA真核表达载体。更优的，每108个大肠杆菌GHOST装载2μgshRNA真核表达载体。其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是通过细菌GHOST内外的电位差装载于细菌GHOST内。本专利技术还提供了上述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物在制备治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中的用途。其中，上述用途中所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。此外，本专利技术还进一步地提供了一种治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物。该药物是由上述述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物添加药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。进一步的，上述治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中所述的制剂为注射剂。所述的注射剂可为注射液或者冻干注射剂。本专利技术也提供了制备上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物的方法。该方法包括以下步骤：a、设计针对Lamp2a的shRNA序列，构建可表达该shRNA序列的表达载体；b、将构建所得的shRNA真核表达质粒装载入细菌GHOST中，制备得到GHOST-shRNA表达载体复合物。本专利技术的有益效果在于，本专利技术在发现LAMP2a在肿瘤相关巨噬细胞中的高表达预示了巨噬细胞高浸润型肿瘤的不良预后的基础上，将构建得到的针对LAMP2a的shRNA真核表达质粒装载入细菌GHOST中，制备得到靶向肿瘤相关巨噬细胞且针对LAMP2a的GHOST-shRNA表达载体复合物。实验证明，该GHOST-shRNA表达载体复合物能够特异的、有效的、低毒性的干扰巨噬细胞中LAMP2a的表达，能够有效治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤，具有很好的应用前景。附图说明图1：大肠杆菌GHOST的OD600曲线。pBV220大肠杆菌是没有溶解蛋白E编码序列的对照组。数据为平均数±标准差，代表性实验。图2：大肠杆菌GHOST装载体系中，上清未被装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST‑shRNA表达载体复合物，其特征在于，所述的GHOST‑shRNA复合物为装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。

【技术特征摘要】
2019.01.03 CN 20191000506241.靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于，所述的GHOST-shRNA复合物为装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是能表达针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA序列。3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体中的shRNA模板序列为SEQNo.1、SEQNo.2、SEQNo.3、SEQNo.4、SEQNo.5或SEQNo.6中的至少一条所示。4.根据权利要求1～3任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体为质粒载体。5.根据权利要求4所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的质粒载体为pENTR/U6、pLKO.1、pGPU6、pGPH1或pGenesil-2中的至少一种。6.根据权利要求1～5任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌、胸膜炎放线杆菌或溶血曼海姆菌中至少一种的GHOST。7.根据权利要求1所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST为大肠杆菌DH5α的GHOST。8.根据权利要求1～7任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的核苷酸序列为SEQNo.7所示。9.根据权利要求1～8任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞博，刘妍彤，魏霞蔚，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51