一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法。所述通用型核酸提取试剂盒包括第一、第二、第三和第四试剂；所述第一试剂为包括2.0‑5.0M胍盐、2.0‑5.0mM金属离子络合剂、100.0‑300.0mM非离子表面活性剂和1.0‑5.0M异丙醇的水溶液；所述第二试剂为包括20.0‑40.0mM柠檬酸和10.0‑30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5‑4.5；所述第三试剂为包括2.0‑10.0mM柠檬酸和1.0‑5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5‑4.5；所述第四试剂为包括5.0‑30.0mM三羟甲基氨基甲烷和1.0‑15.0mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液。本发明专利技术所述试剂盒及其使用方法具有通用强，裂解比高、操作简易、一致性和稳定性好的优点。

A universal nucleic acid extraction kit and its application

The present invention relates to a universal nucleic acid extraction kit and its use method. The universal nucleic acid extraction kit includes the first, second, third and fourth reagents; the first reagent is an aqueous solution containing 2.0 5.0M guanidine salt, 2.0 5.0mM metal ion complexing agent, 100.0 300.0mM non-ionic surfactant and 1.0 5.0M isopropanol; the second reagent is an aqueous solution containing 20.0 40.0mM citric acid and 10.0 130.0mM metal ion complexing agent, with pH value. The third reagent is an aqueous solution comprising 2.0 10.0 mM citric acid and 1.0 5.0 mM metal ion complexing agent with a pH value of 3.5 4.5; and the fourth reagent is an aqueous solution comprising 5.0 30.0 mM trihydroxymethylaminomethane and 1.0 15.0 mM trihydroxymethylaminomethane hydrochloride. The kit and its use method have the advantages of strong universality, high pyrolysis ratio, simple operation, good consistency and stability.

【技术实现步骤摘要】
一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种通用型核酸提取试剂盒。
技术介绍
血液是人类生命的延续，医院在进行血液收集和储备的过程中需要对血液进行病毒筛查以保证医护人员和输血者的安全。此前临床上普遍使用的血液检测技术是酶联免疫法(ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbnentassay)，此方法存在窗口期，容易导致漏检。近年来，核酸扩增技术已经慢慢普及并为直接检测病毒提供了新的方法。和ELISA不同，核酸扩增技术检测的灵敏度更高，大大缩短了病毒携带者的“窗口期”以及检出变异株。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到，检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。目前核酸检测技术已经逐渐得到重视并被广泛采用。核酸检测技术核心步骤之一是核酸提取。使用磁珠法纯化核酸是较为常见的方法，其原理在于使用亲水性的磁珠对裂解后的样品核酸进行充分吸附，再利用磁吸附的方式使超顺性的磁珠从样品溶液中分离出来，通过洗脱得到目的核酸。现有核酸提取方法虽取得进步，但仍存在较多缺陷，具体包括：1)提取时需要加入大于样本比例的裂解液，稀释了样本；2)提取步骤需要5-10步，操作复杂，同时需无水乙醇漂洗、烘干等步骤，容易污染；3)由于蒸发等原因，各样品之间容易造成偏差；4)提取方法的通用性差，大多只能提取DNA或RNA中的一种；5)一些产品的仍然在使用叠氮钠(NAN3)作为防腐剂，具有致癌性。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通用型核酸提取试剂盒以及使用方法，所述试剂盒及其使用方法具有通用强，裂解比高、操作简易、一致性和稳定性好的优点。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种通用型核酸提取试剂盒，所述通用型核酸提取试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；所述第一试剂为包括2.0-5.0M胍盐、2.0-5.0mM金属离子络合剂、100.0-300.0mM非离子表面活性剂和1.0-5.0M异丙醇的水溶液；所述第二试剂为包括20.0-40.0mM柠檬酸和10.0-30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；所述第三试剂为包括2.0-10.0mM柠檬酸和1.0-5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；所述第四试剂为包括5.0-30.0mM三羟甲基氨基甲烷和1.0-15.0mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液。本专利技术所述通用型核酸提取试剂盒中的试剂以及组分是通过大量实验筛选，付出创造性劳动后获得的。其中，所述第一试剂的裂解效率极高，1.0体积的样本只需1.0体积或更少的裂解液(极限情况为0.5)配比就能充分裂解，市面上少有(如CN201810867325.8裂解液：样本配比为2:1、CN201710068589.2配比为5:2等)，降低了成本和提高了反应容器的选择空间；第二、三试剂能有效清洗吸附有核酸的磁珠的杂质；第四试剂可高效洗脱磁珠吸附的核酸。本专利技术所述第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂彼此之间还具有良好的协同配合作用，使得所述试剂盒具有以下优点：(1)良好的通用性，既可提取DNA型核酸病毒，例如HBV，还可提取RNA型核酸病毒，例如HCV和HIV；(2)简化核酸提取方法，将核酸提取步骤由5-10步缩短为3步，且每步时间都相对极短，显著提高了提取效率。(3)试剂盒本身具有良好的稳定性，同时，其在核酸提取过程中表现出一致性好，重复性高的优点。在一些具体的实施方式中，所述第一试剂的所述胍盐的浓度为3.0-4.0M，优选为3.5M；所述金属离子络合剂的浓度为2.0-3.0mM，优选为2.5mM；所述非离子表面活性剂的浓度为130-200mM，优选为166.1mM；所述异丙醇的浓度为3.0-4.0M，优选为3.3M。在一些具体的实施方式中，所述第二试剂的所述柠檬酸的浓度为25.0-35.0mM，优选为31.1mM；所述金属离子络合剂的浓度为15.0-25.0mM，优选为19.0mM；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0。在一些具体的实施方式中，所述第三试剂的所述柠檬酸的浓度为3.0-7.0mM，优选为5.7mM；所述金属离子络合剂的浓度为2.5-4.0mM，优选为3.7M；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0。在一些具体的实施方式中，所述第四试剂的所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-20mM，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1.0-10.0mM。在一些具体的实施方式中，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100，所述第一试剂、第二试剂和第三试剂中的金属离子络合物为柠檬酸钠。在一些具体的实施方式中，所述第二试剂和所述第三试剂中还包括Proclin950，所述Proclin950的体积浓度为0.05～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)。本专利技术所述试剂盒在第二、第三试剂中加入Proclin950，兼具防腐和安全无毒的优点。在一些具体的实施方式中，所述第四试剂中还包括CarrierRNA，所述CarrierRNA的浓度为0.2-2.0μg/μl，优选为1μg/μl。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括蛋白酶K、磁珠、矿物油和核酸内标中的一种或多种。本专利技术所述试剂盒将核酸提取的其他试剂组装至试剂盒，能够进一步提高试剂盒的便捷性。在一些具体的实施方式中，所述磁珠为硅基磁珠，粒径大小为1-1.5μm，优选为1.2μM；所述矿物油为石蜡油；所述核酸内标为盔甲核糖核酸。本专利技术前述试剂盒中第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂的浓度为其工作浓度。可选地，前述试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂和/或第四试剂还可等同替换为可稀释为前述浓度的第一试剂、第二试剂、第三试剂和/或第四试剂的母液。本专利技术还涉及一种使用前述试剂盒提取核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)第一试剂和蛋白酶K裂解样本，加入磁珠吸附裂解释放的核酸；(2)第二试剂和第三试剂依次洗涤吸附核酸的所述磁珠；(3)第四试剂洗脱所述磁珠吸附的核酸。在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述样本、第一试剂、蛋白酶K和磁珠的体积比为1：(0.5-1.2)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)，其中蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL；优选地，所述体积比为1：1：0.02：0.02。在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述磁珠与第二试剂的体积比为1：(10-100)，优选为1：50；所述磁珠与第三试剂的体积比为1：(10-100)，优选为1：50。在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述磁珠与第四试剂的体积比为1：(3-10)，优选为1：6。在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述裂解包括：将样品与各试剂混合，振荡15-45s，优选30s，使样本充分降解；所述吸附包括：加入磁珠后，振荡15-45s，优选30s，之后吸附4-8min，优选6min；在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述洗涤包括：加入第二试剂或第三试剂，振荡15-45s，优选30s，之后吸附15-45s，优选为30s；在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述洗脱包括：加入第四试剂，振荡15-45s，优选30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述通用型核酸提取试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；所述第一试剂为包括2.0‑5.0M胍盐、2.0‑5.0mM金属离子络合剂、100.0‑300.0mM非离子表面活性剂和1.0‑5.0M异丙醇的水溶液；所述第二试剂为包括20.0‑40.0mM柠檬酸和10.0‑30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5‑4.5；所述第三试剂为包括2.0‑10.0mM柠檬酸和1.0‑5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5‑4.5；所述第四试剂为包括5.0‑30.0mM三羟甲基氨基甲烷和1.0‑15.0mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种通用型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述通用型核酸提取试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；所述第一试剂为包括2.0-5.0M胍盐、2.0-5.0mM金属离子络合剂、100.0-300.0mM非离子表面活性剂和1.0-5.0M异丙醇的水溶液；所述第二试剂为包括20.0-40.0mM柠檬酸和10.0-30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；所述第三试剂为包括2.0-10.0mM柠檬酸和1.0-5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；所述第四试剂为包括5.0-30.0mM三羟甲基氨基甲烷和1.0-15.0mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液。2.根据权利要求1所述的通用型核酸提取试剂盒，其特征在于，在所述第一试剂中，所述胍盐的浓度为3.0-4.0M，优选为3.5M；所述金属离子络合剂的浓度为2.0-3.0mM，优选为2.5mM；所述非离子表面活性剂的浓度为130-200mM，优选为166.1mM；所述异丙醇的浓度为3.0-4.0M，优选为3.3M；在所述第二试剂中，所述柠檬酸的浓度为25.0-35.0mM，优选为31.1mM；所述金属离子络合剂的浓度为15.0-25.0mM，优选为19.0mM；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0；在所述第三试剂中，所述柠檬酸的浓度为3.0-7.0mM，优选为5.7mM；所述金属离子络合剂的浓度为2.5-4.0mM，优选为3.7M；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0；在所述第四试剂中，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-20mM，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1.0-10.0mM。3.根据权利要求1所述的通用型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100，所述第一试剂、第二试剂和第三试剂中的金属离子络合物为柠檬酸钠。4.根据权利要求1-3任一项所述的通用型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述第二试剂和所述第三试剂中还包括Proclin950，所述Proclin950的体积浓度为0.05～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)；所述第四试剂中还包括CarrierRNA，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：勾宏娜，叶槟源，邓京，储迅涛，林艳，
申请(专利权)人：珠海丽珠试剂股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44