一种基于溴甲酚绿显色法的γ-环糊精含量分光光度测定方法技术

本发明专利技术公开一种基于溴甲酚绿显色法的γ‑环糊精(γ‑CD)的定量分析方法。该测定方法采用以下实验步骤：(1)测定溶液的准备；(2)样品吸光值差测定：取0.35mmol/L BCG溶液3mL加入50mL棕色比色管中，随后加入γ‑CD溶液2mL，再以pH＝4.4乙酸‑乙酸钠缓冲溶液定容至25mL，震荡摇匀后，于30℃恒温水浴中静置25min，随后在625nm处以缓冲溶液为参比测定其吸光度。在空白实验中，以2mL蒸馏水替代γ‑CD溶液，其余实验操作相同。吸光度差值(ΔA)＝样品吸光度(A)‑空白溶液吸光度(A’)(3)标准曲线的绘制：在各管中分别1mmoL/L、2mmoL/L、3mmoL/L、4mmoL/L、5mmoL/L的γ‑CD溶液，按照上述方法测定各自的吸光值差，随后以环糊精浓度为横坐标，被测样品溶液与空白溶液吸光度差ΔA作图，得到一正相关曲线，作为γ‑CD标准曲线。

Spectrophotometric determination of gamma-cyclodextrin content based on bromocresol green colorimetry

The invention discloses a quantitative analysis method of gamma cyclodextrin (gamma cyclodextrin) (gamma CD) based on bromocresol green colorimetric method. The method adopted the following experimental steps: (1) preparation of solution; (2) determination of difference of absorbance value of sample: 0.35 mmol/L BCG solution 3 mL was added to 50 mL Brown colorimetric tube, followed by 2 mL of gamma-CD solution, and then constant volume to 25 mL with pH=4.4 acetic acid and sodium acetate buffer solution. After shaking, it was placed in a constant temperature water bath at 30 C for 25 minutes, followed by a buffer solution at 625 nm as reference. Determine its absorbance. In the blank experiment, 2 mL distilled water was used to replace the solution of gamma Drawing standard curve of absorbance difference (A)=sample absorbance (A) Line, as the standard curve of gamma CD.

【技术实现步骤摘要】
一种基于溴甲酚绿显色法的γ-环糊精含量分光光度测定方法
本专利技术涉及一种γ-环糊精的定量分析方法，具体为一种基于溴甲酚绿显色法的γ-环糊精含量分光光度测定方法。
技术介绍
环糊精(cyclodextrin，简称CD)是由环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉或其相关的物质所得到的环状化合物，最常见的有α-CD、β-CD、γ-CD3种，分别由6、7、8个葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连接而成。CD环外亲水、环内疏水的性质使其能与各种有机物作用形成稳定的复合物，改变有机物的某些性质，从而在食品、医药、农业、化工等领域都具有广泛的用途。在这3种CD中，γ-CD内腔最大，具有更广泛的包埋客体分子的能力，并且其较高的水溶性、突出的乳化特性和安全性，使其在食品、制药和化妆品等领域具有很大的应用空间。而随着γ-CD的生产和应用的日益扩大，就迫切需要一种简便快速测定产品含量的方法。已知测定环糊精的方法有荧光染料法，纸层析斑定量法，旋光度法，还原糖测定法以及高效液相色谱法，各有优缺点。其中高效液相色谱法结果准确，精度高，且能同时测定α、β和γ三种环糊精各自的含量。但是色谱需要昂贵的仪器设备，对实验人员的专业技术水平要求也较高，且测定需要花费较长时间，因此难于在生产单位中广泛应用。相比较而言，分光光度法需要仪器简单，操作容易，在一定条件下测定结果与液相色谱法相近，较适于环糊精的一般生产和使用单位采用。有关γ-CD的分光光度法测定，国外仅有在1984年及2005年有过两次报道。Takashi等人最先进行过研究，并确定了以溴甲酚绿(简称BCG)为指示剂的分光光度法，但其对温度、反应时间等可能影响测定的因素以及测定范围未作研究，这影响了测定结果的可靠性和准确性。在国外，江南大学的刘虹等人该方法进行过改进，仍存在较大不足。此前的测试方法主要不足体现在一下几方面：首先，之前的测试方法中均采用柠檬酸缓冲体系，由于柠檬酸分子尺寸较大，容易占据γ-CD空腔，影响BCG-(γ-CD)包结物的形成，从而影响(γ-CD)测定结果的准确性；其次，此前的方法对测定溶液缓冲容量估计不足，导致pH值不稳，易造成测定结果出现较大波动；第三，测定取样量较小，不仅容易造成操作不便，亦容易带来人为误差，影响测定结果的准确性和稳定性。基于此前γ-CD测定方法在准确度上、可操作性上以及结果稳定性上存在的诸多不足，本专利技术将设计一种基于分光光度测定γ-CD含量的新方法。本方法中以乙酸/乙酸钠缓冲体系替代了原先的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲体系，并增大了缓冲容量，极大地稳定了测定体系的pH，从而提高了测定结果的准确性。此外，在该方法中，还对测定γ-CD的各操作参数及各类因素对测定重复性、准确性的影响进行了系统的分析。本专利技术方法的推广将成为γ-CD工业化生产和加工过程中检测其含量的快速而有效的工具。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术拟解决的技术问题是：提供一种γ-CD的定量分析方法，具体为一种基于溴甲酚绿显色法的γ-CD含量分光光度测定方法(以下简称方法)。该方法主要有以下两方面优点：①对测定液的成分组成进行了优化，改进了缓冲体系，使缓冲溶液中缓冲对分子较难与γ-CD发生包络反应，从而可提高测定结果的准确性。同时较大的缓冲容量可以稳定体系pH，进而提高了测定结果的稳定性。②改进的测试方法，较大的取样量可提高测试方法的简便性、可操作性，在很大程度上避免了样品及人为操作造成的误差，从而进一步提高了测定结果的准确性、稳定性和可重复性。该方法由于采用常规的实验仪器和设备，具有操作简便、省时、成本低、安全性高、再现性强等优点，不仅可保证测定结果的准确性、稳定性和可重复性，且对测定人员技术要求不高，便于在各种类型的γ-糊精的生产加工单位及实验室中推广应用。本专利技术解决所述γ-CD定量分析技术问题的技术方案是，一种基于溴甲酚绿显色法的γ-CD含量分光光度测定方法，该方法的特征在于采用本专利技术所述以下测定步骤：①测定溶液的准备(1)0.35mmol/LBCG溶液。(2)pH＝4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液，由0.2moL/L乙酸钠与0.3moL/L乙酸溶液配置，并由酸度计校准。(3)5mmoL/Lγ-CD溶液，由蒸馏水配置。②样品吸光度测定取0.35mmol/LBCG溶液3mL加入50mL棕色比色管中，随后加入γ-CD溶液2mL，再以pH＝4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至25mL，震荡摇匀后，于30℃恒温水浴中静置25min，在625nm处，以缓冲溶液为参比测定其吸光度。在空白实验中，以2mL蒸馏水替代γ-CD溶液，其余实验操作相同。吸光度差值(ΔA)＝样品吸光度(A)-空白溶液吸光度(A′)③标准曲线的绘制取0.35mmol/LBCG溶液3mL加入数个50mL棕色比色管中，随后分别在各管中加入浓度为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L的γ-CD溶液各2mL，再以pH＝4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液将各管定容至25mL。震荡摇匀后，于30℃恒温水浴中静置25min，在625nm处，以缓冲溶液为参比测定其吸光度。在空白实验中，以2mL蒸馏水替代γ-CD溶液，其余实验操作相同。以环糊精浓度为横坐标，被测样品溶液与空白溶液吸光度差为纵坐标ΔA作图，得到一正相关曲线，作为γ-CD标准曲线。与现有的γ-CD含量分光光度测定技术相比，本专利技术测定方法的创新点主要有以下方面：①测定溶液配方的改进：BCG-(γ-CD)包结物的增色反应是在一定的pH范围内发生的，因此需要采用缓冲溶液来控制光度测定的pH。此前的测定方法中，均采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系。由于柠檬酸分子尺寸较大，容易占据γ-CD的空腔形成包络，从而阻碍了BCG分子与γ-CD包结物的形成，极易影响测定结果的准确性。在本专利技术中的方法中以乙酸-乙酸钠缓冲对替代了柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，由于乙酸分子较小，难以与空腔尺寸较大的γ-CD形成包络，因此不易影响BCG-(γ-CD)包结物的形成，从而消除了缓冲剂分子对γ-CD含量测定结果的影响，提高了本专利技术测定方法的准确性。②测定方法的改进：在之前的测定方法中存在一些缺陷极易影响到测定结果的准确性，如取样量过小(0.1～0.2mL)，一方面给操作带来一定不便，容易引起人为误差，另一方面过小的取样量也容易造成测定结果出现波动。此外，之前的测定方法中，需加入一定体积的纯盐酸，因此可能会对柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系的缓冲能力造成一定影响，出现pH波动，从而对BCG-(γ-CD)的增色反应造成一定影响，进而影响γ-CD测定的准确性。基于上述不足，本专利技术对于测定方法进行了较大改进，主要体现在：(1)提高了指示剂及糊精样品的取样量，从小于0.2mL提高到了3mL，不仅便于操作，同时避免了取样量过小引起的实验误差和数据结果的波动。(2)增大了缓冲溶液的用量，同时去除了在待测溶液中添加强酸的步骤，从而增强了测定溶液的缓冲能力，对测定体系的pH起到极大的稳定作用，最大程度地减小了光度测定结果的波动性，从而进一步提高了本方法中γ-CD含量测定结果的准确性和可重复性。图表说明图1为溴甲酚绿及不同浓度γ-CD与溴甲酚绿形成包络物的吸收光谱；图2为不同测定实验下测得的γ-CD浓度标准曲线。表1为不同测定实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于溴甲酚绿显色法的γ‑环糊精(γ‑CD)的定量分析方法，其特征在于：探剂使用0.35mmol/L浓度的溴甲酚绿(BCG)作为γ‑CD含量测定的指示剂；以pH＝4.4的乙酸/乙酸钠缓冲溶液作为测定γ‑CD含量的缓冲剂，该缓冲剂由0.2moL/L乙酸钠与0.3moL/L乙酸溶液配置，并由酸度计校准；以1～5mmol/L的γ‑CD水溶液作为待测样品溶液。

【技术特征摘要】
1.一种基于溴甲酚绿显色法的γ-环糊精(γ-CD)的定量分析方法，其特征在于：探剂使用0.35mmol/L浓度的溴甲酚绿(BCG)作为γ-CD含量测定的指示剂；以pH＝4.4的乙酸/乙酸钠缓冲溶液作为测定γ-CD含量的缓冲剂，该缓冲剂由0.2moL/L乙酸钠与0.3moL/L乙酸溶液配置，并由酸度计校准；以1～5mmol/L的γ-CD水溶液作为待测样品溶液。2.根据权利要求1所述的γ-CD含量测定方法，其特征在于：0.35mmol/LBCG溶液3mL；浓度为1～5mol/L的γ-CD溶液2mL；以pH＝4.4乙酸/乙酸钠缓冲溶液定容至25mL。3.一种权利要求1所述的γ-CD含量测定方法，该测定方法采用权利要求1所述基于溴甲酚绿显色法的指示剂(探剂)、缓冲溶液和γ-CD待测溶液成分组成和以下实验步骤：①测定溶液的准备(1)0.35mmol/LBCG溶液。(2)pH＝4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液，由0.2moL/L乙酸钠与0.3moL/L乙酸溶液配置，并由酸度计校准。(3)5mmoL/Lγ-CD溶液，由蒸馏水配置。②样品吸光值差测定取0.35mmol/LBCG溶液3mL加入棕色比色管中，随后加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，张昊，牛迁迁，田云，王攀磊，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：天津,12