碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法技术

一种碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法，属于检测技术领域。本发明专利技术的目的是以廉价的生物质玉米秸秆为碳源制备具有荧光的碳量子点，再以碳量子点为基础对其进行修饰制成复合探针，进而检测白色念珠菌的碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法。本发明专利技术首先制备碳量子点，然后对碳量子点氨基化，最后制备复合探针。本发明专利技术制备原料丰富低廉，制备过程简单，灵敏度高，解决了现有方法的问题如干扰因素多、操作复杂、耗时耗力等。

Composite Probe of Carbon Quantum Dots and Method for Detecting Candida Albicans Content

The invention relates to a carbon quantum dot composite probe and a method for detecting the content of Candida albicans, belonging to the field of detection technology. The aim of the present invention is to prepare fluorescent carbon quantum dots using cheap biomass corn straw as carbon source, modify the carbon quantum dots to make composite probes, and then detect the carbon quantum dots of Candida albicans and the method for detecting the content of Candida albicans. The invention first prepares carbon quantum dots, then aminates the carbon quantum dots, and finally prepares composite probes. The invention has rich and low raw materials, simple preparation process and high sensitivity, and solves the problems of the existing methods, such as multiple interference factors, complex operation, time-consuming and labor-consuming, etc.

【技术实现步骤摘要】
碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法
本专利技术属于检测

技术介绍
真菌是生物界中很大的一个群体，种类繁多，在生长过程中会产生一定的毒素，近年来真菌类感染呈逐年上升的趋势。白色念珠菌也称假丝酵母菌，是导致真菌感染的重要因素之一，此外它还是重要的食源性致病菌，因此快速准确检测白色念珠菌的含量在食品安全检测领域具有重要的意义。近年来国内食品检测机构对白色念珠菌的检测几乎全是利用白色念珠菌的形态特征和生理生化特性，用微生物培养的传统方法对白色念珠菌进行分离鉴定。这些传统检测手段均存在一定的缺陷，如常规的平板计数法耗时长、工作量大且易产生假阳性的情况。由于白色念珠菌是一种条件致病菌，其致病性与之存在量效关系，因此定量检测方法的建立对判断食品受污染的程度以及可食用性具有重要的意义。基于以上研究状况，需专利技术一种简单、准确、快速的方法检测白色念珠菌。碳量子点是尺寸在10nm以下、具有单分散性、几何形状近似于类球形的一种新型的荧光碳纳米功能材料。相对于传统有机染料和金属量子点，碳量子点对环境危害小、制备成本低廉、低毒、易于功能化，并且具有良好的生物相容性；因此越来越多的研究者将其广泛地应用在细胞标记、生物成像、药物传输、荧光探针、有机污染物降解、光解水制氢与光催化剂等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是以廉价的生物质玉米秸秆为碳源制备具有荧光的碳量子点，再以碳量子点为基础对其进行修饰制成复合探针，进而检测白色念珠菌的碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法。本专利技术的复合探针：(1)碳量子点的制备：将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30mL去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点；(2)碳量子点氨基化：将1mL乙二胺与步骤(1)中10mL碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天即可，得到的氮掺杂的碳量子点；(3)复合探针的制备：①分别称取50mg的EDC和NHS，溶于5mL氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；②称取7mg水溶性的两性霉素B，溶于2mL的PBS缓冲液中，混匀备用；③将步骤①产生的液体与步骤②产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；④最后将步骤③中的混合液放在透析袋里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素B复合的荧光探针。本专利技术复合探针检测白色念珠菌含量的方法：(1)将食材切成小块，置于锥形瓶中121℃灭菌20min，除去杂菌，备用；(2)从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10mL含步骤(1)中食材的SAB培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；(3)将1mL复合探针与1mL步骤(2)混合液混合均匀；并放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min，使复合探针中的两性霉素B能够与实样中的白色念珠菌充分结合；(4)取1mL步骤(3)中混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用PBS重悬，重复3次；(5)将步骤(4)中的重悬液体置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；(6)将所测得的荧光强度值代入上述制备的荧光标准曲线中，计算出白色念珠菌的含量。本专利技术所述的荧光标准曲线是荧光强度值与白色念珠菌浓度标准曲线，其获得方法是：(1)配制一系列浓度的白色念珠菌溶液样品；(2)将1mL不同浓度的菌液样品分别与1mL复合探针混合均匀；(3)将步骤(2)中的混合液放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min；(4)将步骤(3)中的混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用PBS重悬，重复3次；(5)将步骤(4)中混合溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；(6)以荧光强度值为纵坐标，白色念珠菌的浓度为横坐标，拟合建立荧光标准曲线。本专利技术所述的荧光标准曲线包含由水溶性的两性霉素B获得的荧光标准曲线和由醇溶性的两性霉素B获得的荧光标准曲线。本专利技术制备原料丰富低廉，制备过程简单，灵敏度高，解决了现有方法的问题如干扰因素多、操作复杂、耗时耗力等。具有优点和积极效果如下：(1)专利技术了一种检测白色念珠菌的荧光分光光度法，能够准确、快速检测白色念珠菌的含量；(2)复合探针检测白色念珠菌的检测限为1124cfu/mL；(3)和现有的方法相比，该方法具有良好的特异性，缩短了检测时间，简化了操作流程，节约了检测成本；(4)利用废弃农作物玉米秸秆为碳源制备碳量子点，变废为宝，并且对环境无危害；(5)用醇溶性的两性霉素B替代水溶性的两性霉素B，进一步降低了检测成本。上述检测限单位cfu/mL是指每毫升菌液里有多少菌体量。附图说明图1是碳量子点的XRD图；图2是碳量子点和氮掺杂碳量子点的FTIR图；图3是在最佳激发波长为355nm条件下的荧光强度值与白色念珠菌浓度的关系标准曲线；图4是复合探针中水溶性的两性霉素B被替代为醇溶性的两性霉素B形成新的复合探针；图5展示了复合探针具有良好的特异性。具体实施方式本专利技术主要是以廉价的生物质玉米秸秆为碳源制备具有荧光的碳量子点，并且通过氨基化修饰制备氮掺杂碳量子点(N-CQDs)，最后与两性霉素B结合形成复合探针，进而检测白色念珠菌的含量；同时克服现有检测方法的缺陷，提供一种操作简便、特异性好、快速准确的荧光分光光度法。碳量子点的制备及其氨基化(1)将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30mL去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点。(2)将1mL乙二胺与步骤(1)中10mL碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天即可；得到的氮掺杂的碳量子点装瓶室温保存备用。上述所用秸秆的制备：预先在阳光下暴晒1-2天，之后用粉碎机粉碎即可；透析时将透析袋放入装有去离子水的烧杯中，浸没即可。本专利技术的研究结果证明，不同地域获取的玉米秸秆不影响制备的碳量子点的质量及应用效果。复合探针的制备(1)分别称取50mg的EDC和NHS，溶于5mL氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；(2)称取7mg水溶性的两性霉素B，溶于2mL的PBS缓冲液中，混匀备用；(3)将步骤(1)产生的液体与步骤(2)产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；(4)最后将步骤(3)中的混合液放在透析袋(1000道尔顿)里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素B复合的荧光探针，保存备用。上述EDC和NHS分别为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；两性霉素B为水溶性；PBS的配方为：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KHPO40.24g，pH7.4，体积为1000mL。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碳量子点的复合探针，其特征在于：(1)碳量子点的制备：将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30mL去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2‑3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点；(2)碳量子点氨基化：将1mL乙二胺与步骤(1)中10mL碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2‑3天即可，得到的氮掺杂的碳量子点；(3)复合探针的制备：①分别称取50mg的EDC和NHS，溶于5mL氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；②称取7mg水溶性的两性霉素B，溶于2mL的PBS缓冲液中，混匀备用；③将步骤①产生的液体与步骤②产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；④最后将步骤③中的混合液放在透析袋里透析2‑3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素B复合的荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种碳量子点的复合探针，其特征在于：(1)碳量子点的制备：将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30mL去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点；(2)碳量子点氨基化：将1mL乙二胺与步骤(1)中10mL碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天即可，得到的氮掺杂的碳量子点；(3)复合探针的制备：①分别称取50mg的EDC和NHS，溶于5mL氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；②称取7mg水溶性的两性霉素B，溶于2mL的PBS缓冲液中，混匀备用；③将步骤①产生的液体与步骤②产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；④最后将步骤③中的混合液放在透析袋里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素B复合的荧光探针。2.权利要求1所述的碳量子点的复合探针检测白色念珠菌含量的方法，其特征在于：(1)将食材切成小块，置于锥形瓶中121℃灭菌20min，除去杂菌，备用；(2)从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10mL含步骤(1)中食材的SAB培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；(3)将1mL复合探针与1mL步骤(2)混合液混合均匀；...

【专利技术属性】
技术研发人员：于大禹，王领，乔楠，王磊，张晓君，郑胜，周环宇，
申请(专利权)人：东北电力大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22