一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法包括以下步骤：(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。本发明专利技术通过选择实验条件与当次实验较为一致的比较准确的标准曲线，能显著降低定量误差，提高定量准确性。同时优选方案能显著减少标准品用量，节省耗材，降低定量成本。

A Method for Determining Nucleic Acid Sample Content in Second Generation Genome Sequencing

The invention discloses a method for determining the content of nucleic acid samples for second generation genome sequencing, which comprises the following steps: (1) fluorescence quantitative polymerase chain reaction is performed on one or more given concentration standard products and nucleic acid samples to be tested, and the number of cycles of standard products and nucleic acid samples to be tested under a given fluorescence intensity is obtained; (2) the number of cycles of standard products obtained according to step (1); Choose the suitable standard curve from the standard curve series; (3) Calibrate the concentration of the nucleic acid sample according to the number of cycles and steps of the nucleic acid sample obtained in step (1); (2) Select the standard curve. The method can significantly reduce the quantitative error and improve the quantitative accuracy by selecting a relatively accurate standard curve which is consistent with the current experiment. At the same time, the optimal scheme can significantly reduce the consumption of standard products, save consumables and reduce the quantitative cost.

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法
本专利技术属于基因组测序
，更具体地，涉及一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法。
技术介绍
随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。第二代测序技术平台的应用，包括罗氏公司454测序平台、ABI公司的Solid测序平台，以及Illumina公司的Solexa测序平台，他们对宏基因组的研究起到了重大影响。其中Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器。随着二代测序的应用越来越广泛，测序文库定量的问题随之突显：如果对于文库的定量不够准确，最终测序完毕产出的数据量也会相应的偏差。具体而言，如果核酸样本含量较低，一次测序文库所产出的数据量不够，无疑是对测序耗材以及时间人力的浪费；如果核酸样本含量过高，甚至导致产出过多导致质量很差以至于无法进行生物信息学分析，即爆机导致实验失败。因此对于基因二代测序而言，用于基因组二代测序的核酸样品含量测定问题非常关键，决定了。目前采用的扩增产物的核酸含量测定方法是荧光定量法，目前的荧光定量法的结果准确性受到许多不可控的因素的影响，包括环境温度、人工移液精确度误差、模板浓度过低、随着PCR循环次数增多，会进入平台期，反应进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制条件一致等等。因此目前的荧光定量法的准确度无法满足二代测序扩增产物核酸含量测定的要求，经常造成数据产出量不足或者数据报废的问题。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其目的在于通过使用较为准确的标准曲线替代当次实验可能效果不好的标准曲线，由此解决现有的用于基因二代测序的核酸样品含量测定方法定量结果不准确的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99；所述各标准曲线的制作标准一致。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线按照如下方法制作：(2-1)对于包括有效浓度范围内给定的浓度呈梯度的2个或2个以上的标准品，按照预设条件进行荧光定量链式聚合反应，获得给定荧光强度下各给定浓度标准品的循环次数；(2-2)通过最小二乘法对步骤(2-1)中获得的循环次数及给定的对数值拟合标准曲线，并计算所述标准曲线的线性相关系数；(2-3)当所述标准曲线现性相关系数大于或等于0.99时，且斜率处于-3.1至-3.6之间时，优选地，且当步骤(2-1)的标准品中包括相同浓度的标准品时，其循环次数差异不超过0.2时，将步骤(2-2)获得的标准曲线纳入标准曲线系列；否则弃用所述标准曲线。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(1)采用5个或5个以上阶梯浓度给定浓度标准品时，可就所述多个阶梯浓度的标准品制作标准曲线，若所述标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99，则将所述标准曲线纳入所述标准曲线系列，并作为适用的标准曲线。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(2)所述适用的标准曲线，同时满足以下条件：条件1：在标准曲线所在的坐标平面内，体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及其循环次数的点与所述标准曲线之间的距离小于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度及其循环次数的点与所述标准曲线系列中其他任意标准曲线之间的距离；条件2：用于制作所述标准曲线的体现标准品浓度对数值与循环次数的点中至少存在一个点，其与所述标准曲线之间的距离大于或等于体现步骤(1)中标准品给定浓度对数值及循环次数的点与所述标准曲线之间的距离。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(2)没有同时满足条件1和条件2的标准曲线时，则从步骤(1)开始重复；当步骤(2)获得唯一同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择所述标准曲线作为适用的标准曲线；当步骤(2)获得多条同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择其中一条作为适用的标准曲线。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其重复步骤(1)时，采用多个给定浓度的标准品；优选地，重复步骤(1)中采用多个例如5个及以上给定浓度呈梯度的标准品。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其当步骤(2)获得多条同时满足条件1和条件2的标准曲线时，选择与其相应的体现标准品浓度对数值与循环次数的点距离最近的标准曲线作为适用的标准曲线。优选地，所述用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其步骤(1)在对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品进行荧光定量聚合酶链式反应时，同时同批次对至少一个定量参考品进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下定量参考品的循环次数；还包括以下步骤：(4)根据步骤(1)中获得的定量参考品的循环次数和步骤(2)中选择的标准曲线，标定定量参考品的浓度，根据定量参考品的浓度校正待测核酸样品的相对浓度。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：本专利技术通过选择实验条件与当次实验较为一致的比较准确的标准曲线，能显著降低定量误差，提高定量准确性。同时优选方案能显著减少标准品用量，节省耗材，降低定量成本。附图说明图1是实施例1标准品和备选的标准曲线；图2是实施例2中标准品和备选的标准曲线；图3是实施例3中标准品和备选的标准曲线。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本专利技术提供了一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，包括以下步骤：(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，按照标准曲线系列中标准曲线制作时的条件进行荧光定量聚合酶链式反应(Qpcr)，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；优选地，在对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品进行荧光定量聚合酶链式反应时，同时同批次对至少一个定量参考品进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下定量参考品的循环次数。所述定量参考品其浓度根据二代测序下机实验确认为合适，认定其相对浓度为1。(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；所述标准曲线体现初始浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对一个或多个给定浓度标准品以及待测核酸样品，进行荧光定量聚合酶链式反应，获得给定荧光强度下标准品及待测核酸样品的循环次数；(2)根据步骤(1)中获得的标准品的循环次数，从标准曲线系列中选择适用的标准曲线；(3)根据步骤(1)中获得的待测核酸样品的循环次数和步骤(2)选择的标准曲线，标定待测核酸样品的浓度。2.如权利要求1所述的用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线体现初始浓度的对数和循环次数之间的线性关系；3.如权利要求2所述的用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99；所述各标准曲线的制作标准一致。4.如权利要求2所述的用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，步骤(2)所述标准曲线系列中，各标准曲线按照如下方法制作：(2-1)对于包括有效浓度范围内给定的浓度呈梯度的2个或2个以上的标准品，按照预设条件进行荧光定量链式聚合反应，获得给定荧光强度下各给定浓度标准品的循环次数；(2-2)通过最小二乘法对步骤(2-1)中获得的循环次数及给定的对数值拟合标准曲线，并计算所述标准曲线的线性相关系数；(2-3)当所述标准曲线现性相关系数大于或等于0.99时，且斜率处于-3.1至-3.6之间时，优选地，且当步骤(2-1)的标准品中包括相同浓度的标准品时，其循环次数差异不超过0.2时，将步骤(2-2)获得的标准曲线纳入标准曲线系列；否则弃用所述标准曲线。5.如权利要求2所述的用于基因组二代测序的核酸样品含量测定方法，其特征在于，当步骤(1)采用5个或5个以上阶梯浓度给定浓度标准品时，可就所述多个阶梯浓度的标准品制作标准曲线，若所述标准曲线的线性相关系数大于或等于0.99，则将所述标准曲线纳入所述标准曲线系列，并作为适用的标准曲线。6.如权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钏，侯玉彬，向浩，张露露，
申请(专利权)人：武汉至纯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42