The present invention relates to the construction method and application of an animal model of immunodeficient rats. The expression vectors of sgRNA in Rag1 gene exon 2, Rag2 gene exon 3 and Il2rg gene exon 1 of rats are constructed respectively. By transcription and expression in vitro, the rats with both Rag1 gene and Rag2 gene knocked out are obtained, and the rats with Il2rg gene knocked out are obtained. Rag1, Rag2 and Il2r are obtained by hybridization. Rats with G gene knockout. The SD RG constructed by the method of the invention has the immunodeficiency phenotype, is convenient for transplanting various tumors and supports their rapid growth, and can be widely used in various fields such as humanized animal models, stem cells and cancer research.
【技术实现步骤摘要】
一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用
本专利技术属于动物基因工程和遗传修饰领域,尤其是涉及一种基于基因敲除技术的免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用。
技术介绍
人源化动物模型体内重建了人源免疫系统,能够更好的模拟人体肿瘤微环境,在肿瘤的在体研究中越来越受到重视。目前,人源化小鼠模型已经应用在新型抗癌药物的筛选以及治疗方法(如细胞治疗和抗体治疗)的探索等各方面。在小鼠中敲除重组活性基因(RecombinationActivationGenes,Rag1或Rag2)能够导致T细胞受体和B细胞的免疫球蛋白编码基因区域的基因重组的障碍,造成小鼠的严重免疫缺陷表型Il2rg基因编码一种跨膜蛋白,是几种白介素受体复合物的共同亚基,在免疫细胞分化和功能中起重要作用。敲除Il2rg基因能够清除小鼠体内的NK细胞,因此在建立免疫缺陷动物模型方面有着重要的作用。通过移植人胎儿胸腺、淋巴结、脾脏的同时从尾静脉注射胎儿肝脏细胞,或者移植造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC),能够建立人源化小鼠模型。已知Rag和Il2rg基因敲除品系小鼠提高了人源组织和细胞的移植效率,成功在小鼠体内分化出了不同亚型的造血细胞,包括T、B淋巴细胞、髓系的巨噬细胞、树突状细胞和血小板、红细胞等。虽然人源化小鼠模型在研究肿瘤药物中已经得到较广泛的应用,但其局限性也是明显的。小鼠的体型小,血液量少;而且受到伦理学的限制,在PDX模型中肿瘤的大小不能超过动物体重的十分之一。如果采用与人类更加接近的大型哺乳动物甚至非人灵长类动物,研究成本又将无法有效控制,因此也不现实。大鼠的体 ...
【技术保护点】
1.一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)分别构建表达载体;所述表达载体分别为特异性靶向大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Rag2基因第3外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体;(2)通过体外转录分别表达得到大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA、Il2rg基因第1外显子的sgRNA、以及Cas9mRNA;(3)将大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA和Cas9mRNA分别纯化后,混合,注射入大鼠受精卵细胞中,移植入大鼠输卵管中,获得同时敲除了Rag1基因和Rag2基因的大鼠;将大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA和Cas9mRNA分别纯化后,混合,注射入大鼠受精卵细胞中,移植入大鼠输卵管中,获得敲除了Il2rg基因的大鼠;(4)将步骤(3)获得的所述同时敲除了Rag1和Rag2基因的大鼠和所述敲除了Il2rg基因的大鼠杂交,获得Rag1、Rag2和Il2rg基因均敲除的免疫缺陷大鼠动物模型SD‑RG。
【技术特征摘要】
1.一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)分别构建表达载体;所述表达载体分别为特异性靶向大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Rag2基因第3外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体;(2)通过体外转录分别表达得到大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA、Il2rg基因第1外显子的sgRNA、以及Cas9mRNA;(3)将大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、Rag2基因第3外显子的sgRNA和Cas9mRNA分别纯化后,混合,注射入大鼠受精卵细胞中,移植入大鼠输卵管中,获得同时敲除了Rag1基因和Rag2基因的大鼠;将大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA和Cas9mRNA分别纯化后,混合,注射入大鼠受精卵细胞中,移植入大鼠输卵管中,获得敲除了Il2rg基因的大鼠;(4)将步骤(3)获得的所述同时敲除了Rag1和Rag2基因的大鼠和所述敲除了Il2rg基因的大鼠杂交,获得Rag1、Rag2和Il2rg基因均敲除的免疫缺陷大鼠动物模型SD-RG。2.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述大鼠Rag1基因第2外显子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;所述大鼠Rag2基因第3外显子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示;所述大鼠Il2rg基因第1外显子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。3.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中,利用CRISPR/Cas9技术,针对大鼠Rag1基因第2外显子、大鼠Rag2基因第3外显子、大鼠Il2rg基因第1外显子分别设计靶向DNA序列,构建大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Rag2基因第3外显子的sgRNA的表达载体、大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA的表达载体;所述靶向DNA序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3序列。4.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(2)通过转录分别得到的Cas9mRNA、sgRNA分别进行吸附柱纯化;其中,纯化后Cas9mRNA终浓度为20-100ng/μl;纯化后大鼠Rag1基因第2外显子的sgRNA、大鼠Rag2基因第3外显子的sgRNA、大鼠Il2rg基因第1外显子的sgRNA的终浓度分别为10-50ng/μl。5.如权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述sgRNA与Cas9mRNA混合时,sgRNA与Cas9mRNA的质量...
【专利技术属性】
技术研发人员:祝献民,范国平,
申请(专利权)人:江苏艾尔康生物医药科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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