低起始量的DNA文库构建方法技术

一种低起始量的DNA文库构建方法，该方法包括：取基因组DNA加入标记有生物素的随机引物进行退火并进行扩增反应；分离纯化全基因组扩增产物；对分离纯化的产物进行末端补平得到线性平末端DNA；在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应；纯化获得双链环状DNA，然后将双链环状DNA打断成线性DNA片段；使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段；对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应；在加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头；对连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。本方法利用生物素标记的随机引物对少量基因组DNA进行随机扩增，同时实现基因组DNA的放大、截短和生物素标记，从而实现低起始量投入的大片段DNA文库构建。

Construction of DNA Library with Low Initial Quantity

A low initial DNA library construction method includes: annealing and amplification of genomic DNA with random primers labeled with biotin; isolation and purification of whole genome amplification products; end flattening of purified products to obtain linear flat-end DNA; ligase ligation reaction to flattened linear flat-end DNA; and purification to obtain double-stranded DNA. Cyclic DNA is then broken into linear DNA fragments; linear DNA fragments labeled with biotin are captured by streptomycin beads; the captured linear DNA fragments are repaired and reacted with A-tail base; the linear DNA fragments after A-tail base reaction are joined at both ends; the products of the joints are amplified by PCR to obtain DNA library. In this method, a small amount of genomic DNA was randomly amplified with biotin-labeled random primers, and genomic DNA was amplified, truncated and biotin-labeled at the same time, so that a large DNA library with low initial input could be constructed.

【技术实现步骤摘要】
低起始量的DNA文库构建方法
本专利技术涉及文库构建
，具体涉及一种低起始量的DNA文库构建方法。
技术介绍
高通量测序(High-ThroughputSequencing)，即下一代测序技术(Nextgenerationsequencing)，是通过在高密度生物芯片上实现大规模平行测序，具有数据产量高，单位数据量成本低的特点。但其缺点在于测序读长短，一般测序长度为2X300bp或者2X150bp。获得的短读长序列在无参考基因组比对拼接，或者含有高度复杂结构序列的基因组时，序列的比对和拼接会非常困难。此时，通过大跨度的大片段文库(matepairlibrary)可以辅助短序列的拼接组装。此外，通过link算法对大片段文库进行分析，可以检测染色体大片段的结构变异，如插入、缺失、倒位、异位等。目前市面上的大片段文库构建商业试剂盒主要分为物理法和酶切法两种，物理法如Illumia公司提供的MatepairLibraryV2试剂盒，能够构建2-10Kb插入片段的文库，起始投入DNA要求4微克以上；酶切法如VAZYME公司的用于Illumia平台的VAHTSMatePairLibraryPrepKit，可提供切胶法和非切胶法两种建库策略，其中切胶法可以构建5-10Kb的插入片段文库，起始投入量为4微克DNA，非切胶法只需要投入1微克DNA，但插入片段较为弥散，主要插入片段大小为1500-2000bp。基于物理法的大片段文库构建方法主要是通过超声波将基因组DNA打断成特定大小范围的片段化DNA，再通过末端修复或者接头连接的方式在片段化DNA的两端标记上生物素，然后连接环化形成双链环状DNA，未环化的线性DNA则用内切酶消化。环状DNA再次使用超声波随机打断成200～400bp主峰的片段化DNA，此时部分片段DNA(即连接环化时的连接处片段)携带有生物素标记，而部分片段DNA没有携带。使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的DNA片段，未标记生物素的DNA片段则被洗去。捕获下来的DNA再经过一系列末端修复、加“A”和接头连接、PCR扩增反应后即可获得大片段文库。基于物理法的大片段文库构建方法，一方面起始投入DNA要求较高，因为超声波打断会使得基因组DNA被随机降解，造成DNA的大量损耗；另一方面通过末端修复的方式在片段DNA两端标记生物素的方式效率相对较低。使得很多没有标记上的DNA白白浪费，进一步提高了初始DNA投入需求量。此外物理法还必须依赖特定的超声波打断设备，并且整个建库流程相比于酶切法来说，更为繁琐。基于酶切法的大片段文库构建方法，则主要是通过转座酶将标记有生物素的识别序列随机插入到基因组DNA中，同时使DNA随机片段化成合适大小。补平后同样采用平末端连接环化，内切酶消化未环化的线性DNA，超声波打断成小片段DNA，链霉素磁珠捕获生物素标记的DNA片段，后续流程与物理法一致。基于酶切法的大片段文库构建方法，相比于物理法有一定优势，其在于操作简单，无需特定的超声波打断设备。但由于转座酶处理的片段DNA大小比较难以控制并且整个片段范围比较弥散。所能分离获得的特定大小片段的DNA则比较少，不足以满足双链环化的需求，反之则需要提高起始投入DNA量来弥补这一缺陷。此外酶切反应极易受到DNA完整度、纯度的影响，再实际操作过程中会极大的提高建库失败率。从上面的描述中可以看出，大片段文库构建相比于常规的文库构建，主要需要将基因组DNA打断成合适的片段范围(如2-10Kb)并且在DNA片段的两端标记上生物素，标记产物平末端连接形成双链环状DNA，打断后链霉素磁珠捕获等环节。这些环节都会损失大量的DNA，不得不提高起始DNA投入量。从应用上来说，大片段文库主要应用在基因组组装和染色体结构变异检测方面。在传统的基因组组装中，所能提供的DNA量往往比较充足。但随着这一技术应用在临床染色体结构变异检测中，所面临的一些样本类型可能比较难以获得或者量比较少，比如肿瘤穿刺样本、羊水细胞、石蜡切片等等。这时样本DNA可能就无法满足常规大片段建库的需求。因此开发一种低起始量的大片段建库方法则有利于解决这一问题。
技术实现思路
本申请提供一种低起始量的DNA文库构建方法，该方法利用生物素标记的随机引物对少量基因组DNA进行随机扩增，同时实现基因组DNA的放大、截短和生物素标记，从而实现低起始量投入的大片段DNA文库构建。本专利技术通过如下技术方案实现：一种低起始量的DNA文库构建方法，包括如下步骤：(1)取10-50ng基因组DNA作为模板，加入标记有生物素的随机引物进行退火，并在扩增酶的作用下进行扩增反应，获得上述基因组DNA的全基因组扩增产物；(2)分离纯化上述全基因组扩增产物；(3)对分离纯化的上述全基因组扩增产物进行末端补平得到线性平末端DNA；(4)在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应，形成双链环状DNA；(5)纯化获得上述双链环状DNA，然后将上述双链环状DNA打断成线性DNA片段；(6)使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段；(7)对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应；(8)在上述加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头；和(9)对上述连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。在优选实施例中，上述步骤(2)中，使用琼脂糖凝胶电泳并切胶回收分离纯化上述全基因组扩增产物。在优选实施例中，上述步骤(2)中，分离纯化的全基因组扩增产物的片段大小在3-6Kb。在优选实施例中，上述步骤(4)中，在上述连接反应之后，加入外切酶消化未成环的上述线性平末端DNA。在优选实施例中，上述步骤(5)中，使用超声波打断仪将上述双链环状DNA打断成线性DNA片段。在优选实施例中，上述步骤(5)中，打断成的线性DNA片段的主峰为200-400bp。在优选实施例中，上述步骤(1)中，标记有生物素的随机引物的序列为BIO-GAGANNNNNNNN(SEQIDNO：1)，其中BIO为生物素标记，NNNNNNNN为8碱基随机序列。在优选实施例中，上述步骤(1)中，上述扩增酶是phi29DNA聚合酶。在优选实施例中，上述步骤(8)中，上述接头的序列如下：通用接头序列：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQIDNO：2)；DNA接头96-X：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQIDNO：3)，其中NNNNNNNN为用于文库拆分的标签序列。在优选实施例中，上述步骤(9)中，上述PCR扩增使用的引物如下：正向引物：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDNO：4)；反向引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO：5)。本专利技术采用全基因组恒温扩增对少量基因组DNA进行随机扩增，极大减少了大片段建库投入起始所需DNA量，使得许多样本稀少或者取样困难的样本类型也可用于大片段文库检测。采用标记了生物素的随机引物进行全基因组扩增，扩增产物直接在两端标记上了生物素，可用于后续环化及磁珠捕获，缩减了实验流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低起始量的DNA文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）取10‑50ng基因组DNA作为模板，加入标记有生物素的随机引物进行退火，并在扩增酶的作用下进行扩增反应，获得所述基因组DNA的全基因组扩增产物；（2）分离纯化所述全基因组扩增产物；（3）对分离纯化的所述全基因组扩增产物进行末端补平得到线性平末端DNA；（4）在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应，形成双链环状DNA；（5）纯化获得所述双链环状DNA，然后将所述双链环状DNA打断成线性DNA片段；（6）使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段；（7）对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应；（8）在所述加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头；和（9）对所述连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。

【技术特征摘要】
1.一种低起始量的DNA文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）取10-50ng基因组DNA作为模板，加入标记有生物素的随机引物进行退火，并在扩增酶的作用下进行扩增反应，获得所述基因组DNA的全基因组扩增产物；（2）分离纯化所述全基因组扩增产物；（3）对分离纯化的所述全基因组扩增产物进行末端补平得到线性平末端DNA；（4）在补平的线性平末端DNA中加入连接酶进行连接反应，形成双链环状DNA；（5）纯化获得所述双链环状DNA，然后将所述双链环状DNA打断成线性DNA片段；（6）使用链霉素磁珠捕获标记有生物素的线性DNA片段；（7）对捕获的线性DNA片段进行末端修复以及加A尾碱基反应；（8）在所述加A尾碱基反应后的线性DNA片段两端连接接头；和（9）对所述连接接头的产物进行PCR扩增得到DNA文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，使用琼脂糖凝胶电泳并切胶回收分离纯化所述全基因组扩增产物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，分离纯化的全基因组扩增产物的片段大小在3-6Kb。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，在所述连接反应之后，加入外切酶消化未成环的所述线性平末端DNA。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，使用超声波打断仪将所述双链环...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建国，陈川，杨传春，张瑜巨，庄丽雯，
申请(专利权)人：深圳乐土生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44