一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法技术

本发明专利技术是一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，包括以下步骤：设计特异性sgRNA；人工合成寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；利用T4/T7 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；将连接产物转化大肠杆菌提取质粒后得到编辑载体库。本发明专利技术利用双链退火原理构建了一种规模化基因编辑载体构建的方法，具有很好的正确率、覆盖度和均一性，可通过一次操作实现成百上千个基因编辑载体的构建，大幅提高载体构建效率，对于各物种基因功能研究和种质资源开发都具有重要意义。

A Fast Construction Method of CRISPR/Cas9 Gene Editing Vector Library

The present invention is a rapid construction method of CRISPR/Cas9 gene editing vector library, which includes the following steps: designing specific sgRNA; synthesizing oligonucleotide DNA and adding sticky terminal DNA base at the 5'end of upstream and downstream primers, annealing DNA oligonucleotides to form double-stranded sgRNA, and connecting double-stranded sgRNA to digestion linear CRISPR/Cas9 plasmid by T4/T7 DNA ligase; The conjugates were transformed into E. coli to extract plasmids and then the library of editing vectors was obtained. The invention constructs a method for constructing large-scale gene editing vectors based on double-strand annealing principle, which has good accuracy, coverage and uniformity. It can construct hundreds of gene editing vectors by one operation, and greatly improves the efficiency of vector construction. It is of great significance for the research of gene function of each species and the development of germplasm resources.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法
本专利技术涉及一种快速构建基因编辑载体库的方法，具体涉及一种快速构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
自2012年以来，一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术（下称基因编辑）得到广泛应用，它原理简单、编辑高效、成本低廉，已成为动植物基础研究及应用上的主流生物技术。基因编辑技术的关键是插入20bp的sgRNA向导序列。目前主流的插入方法包括重叠PCR法和双链退火法两种。重叠PCR法已经在多篇文献中报道，然而，PCR扩增过程中均一性差，极易出现偏好扩增，使部分sgRNA数量占优势，导致低丰度sgRNA打靶基因的编辑十分困难。双链退火法不经过扩增步骤，因此理论上均一性高于重叠PCR法，是一种很好的建库方式。然而，由于双链退火法产生的双链DNA长度过短，建库时连接效率低。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种利用双链退火原理快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法。本专利技术的技术方案具体如下：一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤（1）、基于编辑位点设计特异性sgRNA，并以G碱基开头NGG碱基（N代表任意碱基）结尾避免PolyT结构的出现。步骤（2）、人工合成步骤（1）中成对互补的寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；步骤（3）、将步骤（2）中的上下游DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；步骤（4）、利用T4/T7DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；步骤（5）、将步骤（4）的连接产物转化大肠杆菌，得到可用于后续实验的大肠杆菌菌体库和编辑载体库。进一步地，步骤（3）中，双链退火具体如下：用无菌超纯水稀释到100ng/μl，上下游引物各吸取5-200μl的PCR管中，移至PCR仪退火，退火完成后加无菌超纯水稀释稀释10倍；退火程序为：95℃5min，-0.1℃/5-10s，退火至25℃。进一步地，步骤（4）中的CRISPR/Cas9质粒包括Cas9和sgRNA的表达框。本专利技术还涉及的上述的方法得到的编辑载体库。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：（1）本专利技术首次建立了基于双链退火原理的建库方法，实现了各sgRNA之间高度的均一性，是一种高效的基因编辑载体库构建方法。（2）本专利技术可实现通过一次连接构建规模性的载体库，同时保证高度的均一性，解决目前的基因编辑载体构建方法单个进行，当构建成百上千的编辑载体时需要重复操作，造成时间和资源的浪费的问题，对于动植物及微生物基因功能研究和种质资源开发都具有重要意义。附图说明图1是基因编辑载体库构建的流程图；图2是本专利技术构建的载体骨架图谱；图3是本专利技术的基因编辑菌体库单克隆测序统计结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1CRISPR/Cas9基因编辑载体库构建。如图1所示，本实施例的CRISPR/Cas9基因编辑载体库构建方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、针对201个编辑位点人工合成402条DNA寡核苷酸（SEQIDNo.1-402），每条序列长度为25nt。步骤（2）、将人工合成的402条DNA寡核苷酸双链退火，具体如下：将402条DNA寡核苷酸用无菌超纯水稀释到100ng/μl，上下游引物各吸取5μl至200μl的PCR管中，移至PCR仪退火，随后加无菌超纯水稀释至100μl。退火程序为：95℃5min，-0.1℃/8s，退火至25℃。随后将其按1：1比例转移至一个离心管中，形成sgRNA库。步骤（3）、BsaI酶切基因编辑骨架载体，琼脂糖凝胶电泳回收得到具有相应粘性末端的线性骨架载体。步骤（4）、取50-100ngBsaI酶切线性化的骨架载体，1-5μlsgRNA库，利用T4DNA连接酶体系16℃连接2小时，形成sgRNA连接库。步骤（5）、利用DNA回收试剂盒（E.Z.N.A.®GelExtractionKit）得到sgRNA连接库高纯度DNA。步骤（6）、将步骤（5）中高纯度DNA与大肠杆菌超级感受态（全式金生物Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell）混合，电转化，形成基因编辑菌体库，随后将其全部涂布在LB抗性培养基中，恒温培养箱中37℃培养24小时。步骤（7）、刮取培养基中全部菌落提取质粒（序列如：SEQIDNo.403），获得最终基因编辑载体库。本实施例构建的载体图谱如图2所示。步骤（8）、步骤（6）随机挑取一皿大肠杆菌菌斑进行一代DNA测序，测序引物为全式金克隆载体pEasy-Blunt-zero的通用引物M13-R序列为：caggaaacagctatgac（SEQIDNo.404），共检测大肠杆菌样本677个，正确率为89.9%，对201个载体的覆盖度达90.5%，重复测到10次以下样本占97%，结果如图3所示，表明该方法构建的基因编辑载体库有很高的正确率、覆盖度和均一性。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。序列表<110>云南中烟工业有限责任公司<120>一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法<160>404<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>1gattggtagattccgcgaaggtcac25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>2aaacgtgaccttcgcggaatctacc25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>3gattgagaacttcgtaccggaactc25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>4aaacgagttccggtacgaagttctc25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>5gattgaccaagcgtgagatctccaa25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列(无)<400>6aaacttggagatctcacgcttggtc25<210>7&l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤（1）、基于编辑位点设计特异性sgRNA，并以G碱基开头NGG碱基结尾，长度为20‑25nt；步骤（2）、人工合成步骤（1）中成对互补的寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；步骤（3）、将步骤（2）中的上下游DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；步骤（4）、利用T4/T7 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；步骤（5）、将步骤（4）的连接产物转化大肠杆菌，得到编辑载体库。

【技术特征摘要】
1.一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤（1）、基于编辑位点设计特异性sgRNA，并以G碱基开头NGG碱基结尾，长度为20-25nt；步骤（2）、人工合成步骤（1）中成对互补的寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；步骤（3）、将步骤（2）中的上下游DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；步骤（4）、利用T4/T7DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；步骤（5）、将步骤（4）的连接产物转化大肠杆菌，得到编辑载体库...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建铎，李雪梅，陈章玉，杨光宇，向海英，曾婉俐，张涛，高茜，宋春满，许力，蒋佳芮，邓乐乐，杨文武，贾凌，夏庆友，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53