一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒。该试剂盒含有由引物对丙和探针P3组成的成套试剂，引物对丙由引物F3和引物R3组成，引物对丙的靶序列含有特异DNA片段丙；特异DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中序列17所示；探针P3为15‑30个核苷酸组成的单链DNA分子，与特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。采用本发明专利技术提供的试剂盒检测鸭星状病毒，不仅操作步骤简单、检测周期缩短，而且精密度高、特异性好且灵敏度高。本发明专利技术具有重要的应用价值。

A Method for Detecting Duck Stellate Virus and Its Kit

The invention discloses a method for detecting duck stellate virus and a kit for use. The kit contains a set of reagents consisting of primer-pair C and probe P3. Primer-pair C consists of primer F3 and primer R3. The target sequence of primer-pair C contains specific DNA fragment C. The nucleotide sequence of specific DNA fragment C is shown in sequence 17. Probe P3 is a single-stranded DNA molecule consisting of 15 to 30 nucleotides, which complements or is the same as part of specific DNA fragment C. \u3002 Using the kit provided by the invention to detect duck stellate virus, not only the operation steps are simple, the detection period is shortened, but also the precision is high, the specificity is good and the sensitivity is high. The invention has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测鸭星状病毒的方法及其使用的试剂盒。
技术介绍
实时荧光定量PCR技术(RealtimefluorescencequantitativePCR，q-PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量分子检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。由于实时荧光定量PCR技术的扩增及分析等全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，同时该技术可以通过在统一体系中添加标记不同荧光基团的探针实现多重检测，因此实时荧光定量PCR技术是一种具有实时、准确、快速、简便等特点的分子检测技术。鸭病毒性肝炎(DuckViralhepatitis，DVH)是危害养鸭业的主要疾病之一，该病主要由鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus，DHV)引起。DHV曾经分为三个血清型，即鸭肝炎病毒1型(DHV-1)、鸭肝炎病毒2型(DHV-2)、鸭肝炎病毒3型(DHV-3)。DHV-1已更名为鸭甲型肝炎病毒(DuckhepatitisAVirus，DHAV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)，呈世界范围分布，目前已发现的DHAV又可分为3个基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，其中DHAV-1呈世界范围分布，DHAV-2仅在中国台湾省有报道，DHAV-3流行于韩国、越南和中国大陆。鸭肝炎病毒2型和3型均属于星状病毒科禽星状病毒属，现已分别更名为鸭星状病毒1型(Duckastrovirustype1，DastV-1)和鸭星状病毒2型(Duckastrovirustype2，DastV-2)，这两种鸭星状病毒在我国均有检出报道。此外，2013年北京发现了鸭星状病毒3型(Duckastrovirustype3，DastV-3)，DastV-3的GenBank登录号为KT725224.1，这为鸭病毒性肝炎的检测工作又增添一层的困难。目前关于鸭星状病毒的检测技术和方法已经远远满足不了鸭星状病毒引起的肝炎疫情需求。首先现有用于鸭星状病毒检测的多重RT-PCR技术需要两步法PCR扩增，再经过琼脂糖凝胶电泳才能进行结果判读，不仅周期长，整个扩增检测环节需要4-5h，而且操作复杂，同时需要人工介入的步骤多，多次的开盖操作很容易造成检测环境的气溶胶污染，影响结果的判读；其次多重RT-PCR技术检测由于需要添加多对引物在同一体系中进行扩增，由于引物之间的交叉影响，多重RT-PCR的灵敏度要比单重RT-PCR低得多，容易造成一些早期感染样品的漏检，满足不了现代分子检测技术的要求；再者，市面上关于鸭星状病毒检测的技术仅针对于最常见的鸭星状病毒亚型(如DastV-1、DastV-2)的检测技术，很容易造成由其它亚型引起的疫情时(如DastV-3)的漏检或诊断的困难，远远满足不了市场和实际的需求。迄今为止，还没有一种能够覆盖鸭星状病毒全部亚型(DastV-1、DastV-2和DastV-3)的检测试剂盒或检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是检测鸭星状病毒的全部亚型DastV-1、DastV-2和DastV-3。本专利技术首先保护检测鸭星状病毒的成套试剂；所述成套试剂可由引物对丙和探针P3组成；所述引物对丙可由引物F3和引物R3组成；所述引物对丙的靶序列可含有特异DNA片段丙；所述特异DNA片段丙可为如下y1)或y2)：y1)序列表中序列17所示的DNA分子；y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；所述探针P3可为15-30个(如15-21个、21-30个、15个、21个或30个)核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。所述引物F3可为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；a2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子。所述引物R3可为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列8所示的单链DNA分子；b2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子。所述探针P3可为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子。上述任一所述探针P3的一端具有荧光标记，另一端具有荧光淬灭基团。所述荧光标记可为FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed。所述荧光淬灭基团可为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。本专利技术还保护上述任一所述成套试剂中的引物对丙。本专利技术还保护上述任一所述成套试剂的制备方法，可为将上述任一所述引物对丙和上述任一探针P3分别单独包装。本专利技术还保护上述任一所述引物对丙的制备方法，可为将上述任一所述引物F3和上述任一引物R3分别单独包装。本专利技术还保护上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对丙的应用，可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；d2)制备用于检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒的试剂盒；d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒；d3)制备用于鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的试剂盒。本专利技术还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对丙的试剂盒。所述试剂盒还可包括内标。所述内标可为重组质粒甲。所述重组质粒甲可为将双链DNA分子I和克隆载体(如pUC57载体)连接得到的重组质粒。所述双链DNA分子I可为人β-Actin基因特异型保守序列。所述双链DNA分子I的核苷酸序列可如序列表中序列13所示。所述试剂盒还可包括阴性质控品。所述阴性质控品具体可为无菌的TE缓冲液。所述试剂盒还可包括阳性质控品。所述阳性质控品可为重组质粒乙。重组质粒乙可为将双链DNA分子II和克隆载体(如pUC57载体)连接得到的重组质粒。所述双链DNA分子II可为通用型鸭星状病毒特异性保守序列，即在DastV-1、DastV-2和DastV-3中均完全一致的序列。所述双链DNA分子II的核苷酸序列可如序列表中序列14所示。所述试剂盒具体可由上述任一所述成套试剂(或上述任一所述引物对丙)、内标、阴性质控品和阳性质控品组成。本专利技术还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为如下d1)或d3)：d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒。本专利技术还保护一种检测待测样品是否含有或疑似含有鸭星状病毒的方法，具体可为A1)或A2)或A3)。A1)以待测样品的RNA/DNA为模板，以上述任一所述成套试剂进行qPCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述RNA/DNA的qPCR，则待测样品中含有或疑似本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测鸭星状病毒的成套试剂；所述成套试剂由引物对丙和探针P3组成；所述引物对丙由引物F3和引物R3组成；所述引物对丙的靶序列含有特异DNA片段丙；所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：y1)序列表中序列17所示的DNA分子；y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；所述探针P3为15‑30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。

【技术特征摘要】
1.检测鸭星状病毒的成套试剂；所述成套试剂由引物对丙和探针P3组成；所述引物对丙由引物F3和引物R3组成；所述引物对丙的靶序列含有特异DNA片段丙；所述特异DNA片段丙为如下y1)或y2)：y1)序列表中序列17所示的DNA分子；y2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；所述探针P3为15-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段丙中的部分区段反向互补或相同。2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：所述引物F3为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；a2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子；所述引物R3为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列8所示的单链DNA分子；b2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子；所述探针P3为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子。3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：所述探针P3的一端具有荧光标记，另一端具有荧光淬灭基团。4.如权利要求3所述成套试剂，其特征在于：所述荧光标记为FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed；所述荧光淬灭基团为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。5.权利要求1或2所述成套试剂中的引物对丙。6.权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对丙的应用，为如下d1)或d2)或d3)或d4)：d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；d2)制备用于检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒的试剂盒；d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒；d3)制备用于鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒的试剂盒。7.含有权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对丙的试剂盒。8.权利要求7所述试剂盒的应用，为如下d1)或d3)：d1)检测待测样品中是否含有或疑似含有鸭星状病毒；d3)鉴定待测病毒是否为候选的鸭星状病毒。9.一种检测待测样品是否含有或疑似含有鸭星状病毒的方法，为A1)或A2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄超杰，江遥，邹婧，蒋慧，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44