本发明专利技术公开一种FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明专利技术检测了180日龄(卵巢未成熟)和200日龄(卵巢成熟)猪卵巢组织中、不同大小卵泡颗粒细胞中FGFR1 mRNA的相对表达量，以及超表达/干扰FGFR1后颗粒细胞的增殖、凋亡情况，为母猪卵巢卵泡发育过程中的分子机制积累材料。同时，本发明专利技术的结果显示FGFR1基因参与促进颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞的凋亡，进一步说明FGFR1基因可能参与母猪卵巢卵泡的发育和成熟。
Application of FGFR1 gene in porcine ovarian granulosa cells
The invention discloses an application of FGFR1 gene in porcine ovary granulosa cells, belonging to the field of cell engineering and genetic engineering technology. The present invention detects the relative expression of FGFR1 mRNA in granulosa cells of 180 days old (immature ovary) and 200 day old (ovarian mature) porcine ovarian tissues, and the granulosa cells proliferation and apoptosis after overexpression / interference FGFR1, so as to accumulate materials for the molecular mechanism of ovarian follicle development in sows. At the same time, the results of the present invention show that the fibroblast growth factor 1 gene participates in promoting the proliferation of granulosa cells and inhibiting the apoptosis of granulosa cells, which further indicates that the fibroblast growth factor 1 gene may participate in the development and maturation of sow ovarian follicles.
【技术实现步骤摘要】
FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用
本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及一种FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
技术介绍
哺乳动物在初情期后，随着下丘脑-垂体-性腺轴的生长和分泌机能完善，卵巢机能基本成熟，卵巢卵泡在生殖激素的刺激下逐步成熟排卵，并形成一个周期性过程。根据卵泡发育的形态结构变化，可将卵泡大致分为原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡三个生长阶段。卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成。卵泡发育过程中颗粒细胞首先以单层扁平状方式包围一个卵母细胞形成原始卵泡，并在随后的卵泡发育过程中逐渐由扁平状变为立方状或柱状细胞，且持续增殖至数层，形成壁层颗粒细胞和包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞，在这一过程中颗粒细胞可以产生生长因子，并且与卵泡内膜细胞相互作用产生雌激素，为卵母细胞的成熟和排卵提供必要条件。成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblastgrowthfactorreceptor1，FGFR1)是一种跨膜蛋白质，属于受体酪氨酸激酶。研究表明，FGFR1与其配体FGFs结合后，可通过PLCγ、MAPK、PI3K-AKT等信号传导途径，对细胞的增殖、分化、存活和转移过程产生重要作用。目前国内外尚无关于FGFR1的表达变化对猪卵巢颗粒细胞功能调节的相关报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种FGFR1基因在猪未成熟/成熟卵巢和不同大小卵泡颗粒细胞中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。通过基因工程技术改变FGFR1基因在颗粒细胞中的表达量，确定其在猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡中的应用。本专利技术的再一目的在于提供抑制FGFR1基因表达的小干扰RNA片段(siRNA)。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种FGFR1基因在猪未成熟/成熟卵巢和不同大小卵泡颗粒细胞中的应用。体外环境下，在未成熟和成熟的卵巢组织中，成熟卵巢组织中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于未成熟卵巢。体外环境下，在不同大小卵泡颗粒细胞中，大卵泡(≥5mm)颗粒细胞中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于小卵泡(≤3mm)。本专利技术还提供一种FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。体外环境下，FGFR1基因促进卵巢颗粒细胞的增殖，抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。本专利技术提供抑制FGFR1基因表达的siRNA(si-FGFR1)，序列如下：si-FGFR1：5′-CCACCTACTTCTCCGTCAA-3′。本专利技术的验证结果如下：1、本专利技术通过qRT-PCR方法检测到200日龄母猪卵巢组织中FGFR1mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)180日龄母猪(图1)。这些结果说明FGFR1的表达可能参与母猪卵巢发育成熟。2、本专利技术通过qRT-PCR方法检测到猪大卵泡(≥5mm)颗粒细胞中FGFR1基因mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)小卵泡(≤3mm)(图2)。这些结果说明FGFR1的表达可能参与卵巢卵泡的发育。3、本专利技术通过EdU法检测到，在颗粒细胞内超表达FGFR1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的增殖率升高(P<0.01)(图3)，干扰FGFR1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的增殖率降低(P<0.01)(图4)。4、本专利技术通过AnnexinV-FITC/PI技术检测到，在颗粒细胞内超表达FGFR1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的凋亡率降低(P<0.05)(图5)，干扰FGFR1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的凋亡率升高(P<0.01)(图6)。本专利技术以FGFR1基因(GeneID:100153248)为研究对象，采用了分子细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的应用，第一次证实了FGFR1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，并通过超表达和干扰FGFR1基因证实FGFR1能够参与促进猪卵巢颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡，进一步说明FGFR1基因可能参与促进卵巢卵泡的成熟。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术检测了180日龄和200日龄猪卵巢组织中、不同大小卵泡颗粒细胞中FGFR1mRNA的相对表达量，以及超表达/干扰FGFR1后颗粒细胞的增殖、凋亡情况，为母猪卵巢卵泡发育过程中的分子机制积累材料。同时，本专利技术的结果显示FGFR1基因参与促进颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞的凋亡，进一步说明FGFR1基因可能参与母猪卵巢卵泡的发育和成熟。附图说明图1是180日龄和200日龄猪卵巢组织中FGFR1mRNA的相对表达量；图2是大、小卵泡颗粒细胞中FGFR1mRNA的相对表达量；图3是EdU法检测超表达FGFR1后颗粒细胞增殖的结果图；图4是EdU法检测干扰FGFR1表达后颗粒细胞增殖的结果图；图5是AnnexinV-FITC法检测超表达FGFR1后颗粒细胞凋亡的结果图；图6是AnnexinV-FITC法检测干扰FGFR1表达后调控颗粒细胞凋亡的结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本专利技术，并非为了限定本专利技术，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。实施例1构建FGFR1基因超表达载体BioEdit软件分析发现FGFR1基因CDS区序列无BamHI和XbaI两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司，货号V79020)存在BamHI和XbaI酶切位点。primerpremier5.0软件设计FGFR1基因CDS区引物，其上下游引物分别加上BamHI和XbaI酶切位点序列。以猪卵巢颗粒细胞cDNA为模板，PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，命名为pcDNA3.1-FGFR1。实施例2卵巢颗粒细胞的培养(1)取屠宰场采集的卵巢组织放入含1％双抗的PBS或生理盐水中，置于冰上迅速带回实验室；(2)将采集的卵巢在无菌培养室用PBS或生理盐水(含1％双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台，并用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM的离心管中，800rpm室温离心5min；(4)弃去上清，再用DMEM重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％高糖DMEM+10％FBS+1％双抗；(5)用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。所述的双抗为青霉素和链霉素。实施例3卵巢颗粒细胞的接种和转染(1)颗粒细胞汇合度达到90％左右时，弃培养基，用预热的PBS清洗细胞3遍；(2)加入0.25％胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(完全培养基)终止消化；(3)PBS清洗2遍，期间800rpm离心5min；(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.FGFR1基因在猪未成熟/成熟卵巢和不同大小卵泡颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，在未成熟和成熟的卵巢组织中，成熟卵巢组织中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于未成熟卵巢；体外环境下，在不同大小卵泡颗粒细胞中，大于等于5mm的大卵泡颗粒细胞中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于小于等于3mm的小卵泡。
【技术特征摘要】
1.FGFR1基因在猪未成熟/成熟卵巢和不同大小卵泡颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，在未成熟和成熟的卵巢组织中，成熟卵巢组织中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于未成熟卵巢；体外环境下，在不同大小卵泡颗粒细胞中，大于等于5mm的大卵泡颗粒细胞中FGFR1基因的mRNA相对表达量极显著高于小于等于3mm的小卵泡。2.FGFR...
【专利技术属性】
技术研发人员：李加琪，李忠慧，袁晓龙，张哲，钟玉宜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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