一种简化基因组测序文库及其建库方法技术

本发明专利技术提供了一种简化基因组测序文库及其建库方法，在利用磁珠进行片段选择时，利用磁珠结合DNA特性，针对现实中存在片段选择不均匀以及回收效率较低的缺点，优化磁珠纯化大片段和小片段进行去除方法，同时增加异丙醇沉淀，调整组分配比，最终有效的提高片段回收的效率以及不同片段的回收量，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A Simplified Genome Sequencing Library and Its Construction Method

The invention provides a simplified genome sequencing library and its library building method. When using magnetic beads to select fragments, the magnetic beads combined with DNA characteristics can optimize the method of removing large and small fragments of magnetic beads purification, increase the precipitation of isopropanol, adjust the proportion of components, and ultimately extract effectively, in view of the shortcomings of uneven selection of fragments and low recovery efficiency in reality. The high efficiency of fragment recovery and the amount of different fragments recovery have broad application prospects and huge market value.

【技术实现步骤摘要】
一种简化基因组测序文库及其建库方法
本专利技术属于高通量测序
，涉及一种简化基因组测序文库及其建库方法。
技术介绍
随着高通量测序技术的发展，尤其是Illumina高通量测序平台，使得大量物种可以进行全基因组测序，从而获得该物种的遗传信息；目前因为高通量测序精确度的限制，二代测序需要对同一位点进行多次测序，对于人类基因组而言，基因组大小约为3Gb(base)，如果需要准确的获得人类基因组上的变异位点，实际测序的数据量需要对人类基因组测大约90Gb的数据才能满足相关要求，由此产生巨额的费用。相对于全基因组测序，简化基因组测序则有效的弥补了全基因组测序的不足，简化基因组测序(Reduced-RepresentationGenomeSequencing，RRGS)是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序获得大量遗传多态性标签序列来充分代表目标物种全基因组信息的测序策略，由于所回收的产物大多只占整个基因组的0.1～5％，因此成为简化基因组测序。目前常用的简化基因组测序的方法主要包括RAD-Seq(Restriction-siteAssociatedDNASequencing)，GBS测序(Genotypingbysequencing)以及ddRAD(Double-diggestRAD)测序。传统的RAD-seq技术构建文库的方法是先利用限制性内切酶对基因组进行酶切，并连上一端的接头，然后再利用超声打断连接产物，再连接另一端的接头，最后通过磁珠回收或者凝胶回收300～700bp的片段进行高通量测序。传统的GBS建库技术则是通过限制性内切酶进行酶切，然后连上特定的双端接头，通过控制PCR过程中的延伸时间来选择酶切产物的特定片段，一般长度在100～500bp。而ddRAD-seq综合了RAD-seq和GBS两种建库方法的优势，采用两种不同种类的酶进行酶切，通常两种酶的类型一种是稀有酶，一种是常见酶；从而从选酶角度上控制了测序片段的产出，由于采用不同种类的酶同时省去了机械打断的过程，使得片段具有一定的方向性，便于进行目的片段的选择。因此，ddRAD-seq技术是目前简化基因组中最常用的建库方式。ddRAD-seq主要实验步骤包括以下几个方面：酶切，加接头，混池，对混池后的样本进行片段筛选、PCR扩增和PCR产物回收等步骤。片段选择是二代测序建库中必不可缺的步骤，全基因组测序文库中进行片段选择主要是集中到某个特定片段的文库，例如250bp文库，500bp文库以及800bp文库等，而简化基因组所建的文库则是筛选某个片段大小的文库，例如GBS文库筛选片段大小为100bp～500bp，ddRAD文库则筛选的是300bp～700bp区间文库；目前最常用的片段选择是利用磁珠进行分选，目前按照IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation对片段区间进行筛选，经常出现回收效率低以及片段分布不均匀的状况，而对于片段筛选的质量则直接影响了建库的质量，进而影响数据产出。常规片段筛选原则是先通过加入大体积磁珠去除大片段，然后加入小体积的磁珠去除小片段，从而完成特定区段长度的片段选择，但在实际操作中，按照IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况，尤其是当样本数量较少时。因此，研发一种优化的简化基因组测序文库的构建方法，提高回收率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种简化基因组测序文库及其建库方法，在利用磁珠进行片段选择时，针对现实中存在片段选择不均匀以及回收效率较低的缺点，优化磁珠纯化大片段和小片段进行去除方法，同时增加异丙醇沉淀步骤，最终有效的提高片段回收的效率以及不同片段的回收量，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种简化基因组测序文库的建库方法，所述方法包括如下步骤：(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，制备双链接头；(3)将步骤(1)的酶切产物与步骤(2)的接头进行连接，得到连接产物；(4)将步骤(3)的连接产物混合后得到混池，向混池中加入磁珠，进行片段筛选，得到目的片段；(5)向步骤(4)得到的目的片段进行沉淀处理，离心弃上清，得到纯化产物；(6)将步骤(5)得到的纯化产物进行PCR扩增和产物回收，得到所述简化基因组测序文库；步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段；步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；所述第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；所述第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。本专利技术中，专利技术人在长期的科研实践中，发现按照IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况；针对这一缺陷，采用大量实验摸索验证，优化片段筛选和沉淀步骤，创造性地颠倒了去除片段的顺序，先去除小片段，再去除大片段，从而最大程度减少大片段的残留；同时，利用长期实验的经验总结，添加了异丙醇沉淀的步骤，优化了各组分的配比，各步骤各条件相互配合促进，极大地提高了回收产物的产率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。简化基因组是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序，从而获得大量遗传多样性标签来充分代表目标物种全基因组信息的测序策略。此方法相对于全基因组测序而言，实验步骤简单，成本低，而且不依赖于参考基因组就能获得全基因组范围内的遗传多态性标签，因而广泛应用于生态学、进化学和基因组学等领域；GBS：GenotypingbySequencing，测序分型技术；ddRAD：DoublediggestRestriction-siteAssociatedDNASequencing，双限制性内切酶相关的DNA测序。常规片段筛选原则是先通过加入大体积磁珠去除大片段，然后加入小体积的磁珠去除小片段，从而完成特定区段长度的片段选择，但在实际操作中，按照IonXpressTMPlusgDNAFragmentLibraryPreparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况，尤其是当样本数量较少时。本专利技术与常规片段选择有两个区别，第一个区别在于去除大片段和小片段顺序上并不一致，本专利技术先去除小片段，再去除大片段，从而最大程度减少大片段的残留；第二个区别在于纯化过程中采用异丙醇进行沉淀，极大的提高回收产物的产率，相比常规的磁珠片段选择，本方法具有回收效率高，可操作性强，片段的保真度较高(反应在文库上分布较均匀)。优选地，步骤(4)所述先加入的磁珠体积为混池体积的0.6～0.9倍。优选地，步骤(4)所述再加入的磁珠体积为混池体积的0.2～0.5倍。优选地，步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；优选地，第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；优选地，第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简化基因组测序文库的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，制备双链接头；(3)将步骤(1)的酶切产物与步骤(2)的接头进行连接，得到连接产物；(4)将步骤(3)的连接产物混合后得到混池，向混池中加入磁珠进行片段筛选，得到目的片段；(5)向步骤(4)得到的目的片段进行沉淀处理，离心弃上清，得到纯化产物；(6)将步骤(5)得到的纯化产物进行PCR扩增和产物回收，得到所述简化基因组测序文库；其中，步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段；步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；所述第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；所述第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。

【技术特征摘要】
1.一种简化基因组测序文库的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，制备双链接头；(3)将步骤(1)的酶切产物与步骤(2)的接头进行连接，得到连接产物；(4)将步骤(3)的连接产物混合后得到混池，向混池中加入磁珠进行片段筛选，得到目的片段；(5)向步骤(4)得到的目的片段进行沉淀处理，离心弃上清，得到纯化产物；(6)将步骤(5)得到的纯化产物进行PCR扩增和产物回收，得到所述简化基因组测序文库；其中，步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段；步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；所述第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；所述第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述先加入的磁珠体积为混池体积的0.6～0.9倍。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述再加入的磁珠体积为混池体积的0.2～0.5倍。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的异丙醇的浓度为100％的异丙醇原液。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的糖原的浓度为3～10mg/mL；优选地，所述第一次沉淀的醋酸钠的浓度为0.2～0.7mol/mL。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的条件为：-70℃～-80℃静置10～20min，11000～13000rpm，2～6℃离心10～20min弃上清。7.根据权利要求4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘同欣，谢正立，陈业，吴昕，廖国娟，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32