本发明专利技术属于DNA检测技术领域，公开了一种基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法；表面修饰探针为完全互补探针和半互补探针；所述表面修饰探针的制备方法的探针尾部进行巯基修饰，穿过纳米金外层PEG分子，直接与纳米金表面通过巯基结合；得到三种检测反应体系：ccpDNA‑PEG‑AuNPs，hcpDNA1‑PEG‑AuNPs，hcpDNA2‑PEG‑AuNPs。本发明专利技术检测快速：30min完成反应；操作简单；体系简单，不需要精确温度控制，不需要酶参与反应；对检测设备要求不高，只需要UV‑Visible光谱检测；灵敏度高：飞摩尔级别。
High Sensitivity Detection of Functionalized Gold Nanoparticles Based on Nucleic Acid Probe Modification
The invention belongs to the field of DNA detection technology, and discloses a functional gold nano-sensitive nucleic acid detection method based on nucleic acid probe modification; the surface-modified probe is a fully complementary probe and a semi-complementary probe; the probe tail of the preparation method of the surface-modified probe is modified by sulfhydryl group, which passes through the outer PEG molecule of nano-gold and directly binds to the surface of nano-gold through sulfhydryl group; To three detection reaction systems: ccpDNA PEG AuNPs, hcpDNA 1 PEG AuNPs, hcpDNA 2 PEG AuNPs. The method has the advantages of fast detection: 30 minutes to complete the reaction; simple operation; simple system, no precise temperature control and no enzyme to participate in the reaction; low requirement for detection equipment, only UV Visible spectrum detection; high sensitivity: flying molar level.
【技术实现步骤摘要】
基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法
本专利技术属于DNA检测
，尤其涉及一种基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：PCR是应用最广泛的DNA检测技术，特别适合痕量DNA的检测。然而PCR需要针对不同的靶标设计复杂的引物，并且需要精确控制温度的循环，所以难以用于床旁检测(point-of-caretest,POCT)。等温扩增由于不需要精确的温度循环控制，整个反应只需要一个温度条件，因此有望替代PCR成为更有效的DNA检测手段。然而PCR和等温扩增反应都需要用到不同的酶，使用前需要低温保存，参与反应时需要在最适反应温度，因此对反应试剂储存以及反应条件要求严格。得益于化学与纳米技术的发展，许多新的检测方法被引入到核酸检测中，如电化学，光谱成像，显色反应等。其中利用纳米金的表面等离子共振(localizedsurfaceplasmonresonance，LSPR)信号的改变作为核酸检测策略的方法由于其快速高灵敏操作检测而非常适合于POCT。快速高灵敏度的DNA检测对于疾病早期诊断和准确判别有着重要作用。目前应用最广泛的DNA检测PCR需要至少1小时反应时间，同时引物设计复杂，整个扩增过程需要精确的温度控制。纳米金具有独特性质，被广泛应用与生物大分子快速检测，目前在核酸检测领域，基于纳米金的各种检测策略受到广泛关注，如显色反应、表面增强拉曼光谱和电化学等。然而这些检测方法需要结合核酸扩增或酶联级放大等技术，根据信号读取方法，有两种基于纳米金LSPR的核酸检测策略。第一种是由于纳米金对其周围环境或表面吸附物的电介质改变很敏感。待测核酸的加入或者金表面发生的相互作用都会改变其表面的电介常数或折射系数，并相应引起LSPR红移。第二种则是通过核酸引导纳米金之间相互聚集，引起在紫外可见光光谱的高波长区域的吸光值增高或者反应溶液发生颜色变化。两种基于纳米金LSPR的核酸检测策略都不需要酶的参与，对反应温度没有严格要求，室温环境下就可以完成，整个反应过程在30min之内，检测一起紫外分光光度计是基础设备，因此非常适合于POCT。操作复杂不适合POCT床旁快速检测。无放大信号的检测仅在纳摩尔级别，不能满足临床样本中低丰度DNA检测需求。因此亟需开发一种快速、简单且高灵敏的DNA检测试剂。综上所述，现有技术存在的问题是：目前在核酸检测方法需要结合各种扩增等放大技术，操作复杂不适合POCT床旁快速检测。解决上述技术问题的难度和意义：目前单独使用纳米金LSPR方法，检测核酸的灵敏度不够，需要结合其他扩增等放大方法，但这样会增加操作的复杂度，降低了广泛POCT应用的潜能。现场快速检测核酸意义(POCT意义)：POCT是医护工作者在医疗现场应用小型的、便携式、可以即时获得检验结果的仪器进行检测，或者是在医院诊室之外的任意场所实施的多种检测项目的临床检查。POCT的重要意义主要体现在，在更早的时间获得与疾病相关的信息实现早期疾病筛查与诊断，如对心肌损伤标志物的检测可以帮助医生更早识别患者的心肌受损情况，对可疑人群进行肿瘤标志物检测有望实现肿瘤的早期筛查与发现。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法。本专利技术是这样实现的，一种表面修饰探针，所述表面修饰探针为完全互补探针和半互补探针；所述完全互补探针的序列为：SEQIDNO:2；所述半互补探针的序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。进一步，所述表面修饰探针的基底：低分子聚乙二醇修饰的纳米金。本专利技术的另一目的在于提供一种所述表面修饰探针的制备方法，所述表面修饰探针的制备方法的探针尾部进行巯基修饰，穿过纳米金外层PEG分子，直接与纳米金表面通过巯基结合；得到三种检测反应体系：ccpDNA-PEG-AuNPs，hcpDNA1-PEG-AuNPs，hcpDNA2-PEG-AuNPs。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述表面修饰探针的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法，所述功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法包括：-靶标：单链targetDNA；-CCP方法：ccpDNA-PEG-AuNPs溶液中，由于PEG分子以及表面DNA探针之间的相互作用，纳米颗粒有部分聚集，UV检测光谱上表面为高波长段出现肩峰。当加入tDNA与ccpDNA-PEG-AuNPs上的ccp探针完全互补，打破PEG分子以及表面DNA探针之间的相互作用，纳米颗粒解聚，UV检测光谱上表面为高波长段肩峰的峰值降低。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述表面修饰探针的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法，所述功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法包括：hcpDNA1-PEG-AuNPs和hcpDNA2-PEG-AuNPs等体积混合的溶液中，纳米颗粒有部分聚集，UV检测光谱上表面为高波长段出现肩峰；当加入tDNA后，tDNA分别与纳米金上的hcp1以及hcp2探针互补，形成夹心结构，打破PEG分子以及表面DNA探针之间的相互作用，纳米颗粒解聚，UV检测光谱上表面为高波长段肩峰的峰值降低。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：检测快速：30min完成反应；操作简单；体系简单，不需要精确温度控制，不需要酶参与反应；对检测设备要求不高，只需要UV-Visible光谱检测；灵敏度高：飞摩尔级别。附图说明图1是本专利技术实施例提供的基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法实现流程图。图3是本专利技术实施例提供的电镜表征图和吸收光谱表征示意图；图中：(a)PEG-AuNP的电镜表征图；(b)UV-Visble吸收光谱表征：PEG-AuNP(黑色)，hcpDNA1-PEG-AuNP(红色),thehcpDNA2-PEG-AuNP(蓝色),theccpDNA-PEG-AuNP(绿色)。图4是本专利技术实施例提供的UV-Visble吸收光谱示意图；图中：不同浓度tDNA分别用(a)CCP方法和(b)MIX方法检测；图5是本专利技术实施例提供的(a)随着tDNA浓度的增加在580nm处吸光度值(A580)的变化，黑色为CCP方法，红色为MIX方法；(b)对CCP方法中10-15到10-12M浓度的tDNA与吸光度值进行线性拟合；(c)对MIX方法中10-15到10-13M浓度的tDNA与吸光度值进行线性拟合。图6是本专利技术实施例提供的相对于目标DNA的错配单链DNA用两种方法检测的A580值示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的表面修饰探针为完全互补探针和半互补探针；完全互补探针的序列为：SEQIDNO:2；半互补探针的序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。如图1所示，本专利技术实施例提供的基于核酸探针修饰的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法包括以下步骤：S101：ccpDNA-PEG-AuNPs溶液中，由于PEG分子以及表面DNA探针之间的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表面修饰探针，其特征在于，所述表面修饰探针为完全互补探针和半互补探针；所述完全互补探针的序列为：SEQ ID NO:2；所述半互补探针的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
【技术特征摘要】
1.一种表面修饰探针，其特征在于，所述表面修饰探针为完全互补探针和半互补探针；所述完全互补探针的序列为：SEQIDNO:2；所述半互补探针的序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。2.如权利要求1所述的表面修饰探针，其特征在于，所述表面修饰探针的基底：低分子聚乙二醇修饰的纳米金。3.一种如权利要求1所述表面修饰探针的制备方法，其特征在于，所述表面修饰探针的制备方法的探针尾部进行巯基修饰，穿过纳米金外层PEG分子，直接与纳米金表面通过巯基结合；得到三种检测反应体系：ccpDNA-PEG-AuNPs，hcpDNA1-PEG-AuNPs，hcpDNA2-PEG-AuNPs。4.一种应用权利要求1所述表面修饰探针的功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法，其特征在于，所述功能化纳米金高灵敏度核酸检测方法包括：-靶标：单链targetDNA；-CCP方法：ccpDNA-PE...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄姣祺，府伟灵，张阳，刘羽，刘伟，夏珂，陈雪萍，林钟劝，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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