间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用。通过制备脂肪间充质干细胞来源的外泌体，在细胞水平通过Western Blot，流式等实验明确AMSC‑Exo对实质细胞和免疫细胞线粒体自噬的调控作用；同时通过体内实验明确AMSC‑Exo对肝组织中线粒体自噬通路的影响；并进一步制备促线粒体自噬的生物制剂或药物。同时通过对AMSC‑Exo的修饰，以进一步提高其促线粒体自噬效能。本发明专利技术能促进线粒体自噬，纠正线粒体功能障碍；对实质细胞和免疫细胞均具有促线粒体自噬的作用；可用于制备治疗线粒体功能障碍相关疾病的制剂或药物；经特定修饰后，可进一步提高其促线粒体自噬能力。

Application of mesenchymal stem cell exosomes in preparation of mitochondrial autophagy-promoting agents

The present invention provides the application of mesenchymal stem cell exosome in the preparation of mitochondrial autophagy promoting agents. The regulation of AMSC_Exo on mitochondrial autophagy of solid cells and immune cells was confirmed by Western Blot and flow cytometry at the cellular level. The effect of AMSC_Exo on mitochondrial autophagy pathway in liver tissue was also confirmed by in vivo experiments. Biological agents or drugs promoting mitochondrial autophagy were further prepared. At the same time, AMSC Exo was modified to further improve its mitochondrial autophagy promoting effect. The invention can promote mitochondrial autophagy and correct mitochondrial dysfunction; has the function of promoting mitochondrial autophagy to both solid cells and immune cells; can be used to prepare preparations or drugs for treating diseases related to mitochondrial dysfunction; and can further improve the ability of promoting mitochondrial autophagy after specific modification.

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用
本专利技术属于生物
，涉及间充质干细胞来源外泌体的新应用，具体涉及一种脂肪来源间充质干细胞(AMSC)外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用。
技术介绍
线粒体是细胞的能量工厂，健康的线粒体就像是一个动力工厂，通过三羧酸循环和氧化磷酸化来实现能量转换。线粒体功能可决定细胞的生死存亡，一方面其通过氧化磷酸化产生ATP提供细胞的能量需求，并通过钙离子通道将细胞质中的钙离子转运至线粒体储存，使细胞能够维持正常的功能；另一方面线粒体胞内活性氧(ROS)的异常累积以及产生凋亡相关蛋白，如细胞色素C和凋亡诱导因子，会导致细胞受损并诱导细胞死亡。此外，线粒体拥有单独的基因编码系统，因老化或者受损等因素引起的线粒体DNA突变由于线粒体基因构成的特殊性而不易修复。考虑到这些关键因素，损伤的线粒体会对细胞造成伤害，功能障碍的线粒体的积累会导致多种类型疾病，包括心脏衰竭，阿尔茨海默病，帕金森病和癌症。线粒体自噬(mitophagy)是细胞选择性清除损伤或衰老的线粒体，并循环利用其组成元素的过程。线粒体自噬可使细胞内线粒体的质量和数量保持平衡，因而对于维持细胞稳态及细胞生存具有重要意义。研究表明，线粒体自噬在不同致病因素、不同细胞中都具有明显保护作用，其缺陷及功能障碍与衰老、神经退行性疾病和癌症等诸多生理病理过程密切相关。近来，越来越多的研究显示线粒体自噬也参与了多种肝脏疾病的发生发展，在非酒精性脂肪肝、肝纤维化/肝硬化、肝癌和肝缺血再灌注损伤中均存在线粒体自噬障碍。PINK1和PARKIN是线粒体自噬的重要调控分子。Parkin可选择性聚集在线粒体基因突变的线粒体上，并将其清除。PINK1和PARKIN与维持线粒体网络的完整和细胞功能的正常具有密切联系，其编码基因的突变会导致受损线粒体的聚集，进而导致细胞损伤或恶变。因此，上调PINK1和PARKIN介导的线粒体自噬通路可作为去除受损线粒体的潜在治疗策略，有望为多种因素所致的肝脏损伤，以及线粒体自噬障碍相关的疾病治疗提供新的思路和选择。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种间充质干细胞(AMSC)外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用，所述间充质干细胞(AMSC)外泌体来源于脂肪，通过以下步骤实现：1.脂肪来源间充质干细胞(AMSC)的制备：小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC用含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)培养，hAMSC采用含2％MSC培养无血清替代物(EliteCell，EPA-050)的MSC培养基进行培养。AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞用于后续实验；2.AMSC-Exo分离：上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心(4℃，300g，10分钟)；取上清后再次离心(4℃，2000g，10分钟)；再次取上清进行离心(4℃，10,000g，30分钟)，弃沉淀，将上清于100,000g离心70分钟，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心(100,000g，70分钟)，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-Exo)；3.AMSC-Exo鉴定：通过NTA法(NanoparticleTrackingAnalysis)分析其粒径，范围在64.5-143.8nm。并采用WesternBlot或磁珠法(流式细胞术)检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。本专利技术提供的AMSC-Exo制备的促线粒体自噬的生物制剂，该制剂含有有效剂量的AMSC-Exo，将该制剂施用于作用对象可有效促进线粒体自噬，纠正线粒体功能障碍。可用于线粒体功能障碍相关疾病的治疗。本专利技术所述线粒体自噬，涉及的相关疾病包括但不限于急慢性肝损伤、肝炎(包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎)、肝衰竭、肝纤维化/肝硬化、肝硬化等肝脏疾病。所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。本专利技术的另一个目的是提供提高AMSC-Exo促线粒体自噬效能的制备方法(一种是通过在AMSC-Exo的基础上直接电转法荷载特定核酸；一种是通过基因修饰AMSC，使其分泌的AMSC-Exo带有特定核酸)，通过如下步骤实现：1.构建及制备SEQ:NO.1荷载的AMSC-Exo：(1)采用前述制备AMSC-Exo的方法制备AMSC-Exo(包括AMSC制备，AMSC-Exo分离)；(2)采用电转法导入SEQ:NO.1核酸片段：SEQ:NO.1：GCAGGCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAUGAUU将AMSC-Exo和SEQ:NO.1核酸在4℃的电穿孔缓冲液中轻轻混合。以0.4cm的电穿孔试管，在350V和150μF的电压下采用基因脉冲II电转仪(Bio-Rad,USA)进行电穿孔。将混合物在37℃下放置30分钟，以确保AMSC-Exo膜完全恢复。荷载后的AMSC-Exo以预冷的PBS清洗2次(120,000×g超速离心90分钟)以去除未载入的多余核酸序列。2.构建及制备XIST(X非活性特异性转录物)片段修饰的AMSC-Exo：(1)构建XIST修饰的AMSC：XIST慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-XIST感染AMSC。表达质粒包含部分XIST目的片段序列如SEQ:NO.2所示，其特征为对特定ceRNA功能区进行选择性拼接后的片段。SEQ:NO.2ggatgacctctagtcaagacctttgcactaggatagttaatgtgaaccatggcaactgatcacaacaatgtctttcagatcagatccattttatcctccttgttttacagcaagggatattaattacctatgttacctttccctgggactatgaatgtgcaaaattccaatgttcatggtctctccctttaaacctatattctaccccttttacattatagaaagggatgctggaaacccagagtccttctcttgggactcttaatgtgtatttctaattatccatgactcttaatgtgcctgtgtaatagacatgaaagcctcccctgccacaccccacctccaatcttcctttcccttccaccagggagtgtccactccatatacccttacatttggacaatcaaggtgcacaattgtaagtgagcataggcactcaccttggacatgaatgtgcataactgcacatggcccatcccatctgaataaggtcctactctcagaccctttttgcagtacagcaggggtgctgatcaccaaggccccttttcctggcctgttatgtgtgtgattatatttgttccagttcctgtgtaatagaaaacaaccaccacacgtcaagctcttcattgttcctatctgccaaatcattatacttcctacaagcagtgcagagagctgagtcttcagcaggtccaagaaatttgaacacactgaaggaagtcagc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用，所述间充质干细胞外泌体来源于脂肪，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)脂肪来源间充质干细胞的制备：小鼠AMSC和成人AMSC按常规方法分离，小鼠AMSC用含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，成人AMSC采用含2％MSC培养无血清替代物的MSC培养基进行培养，AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞用于后续实验；(2)AMSC‑Exo分离：上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并做第一次离心，取上清后第二次离心，再次取上清进行第三次离心，弃沉淀，将上清于100,000g离心70分钟，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心100,000g，70分钟，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞外泌体；(3)脂肪来源间充质干细胞外泌体鉴定：通过NTA法分析其粒径，范围在64.5‑143.8nm。并采用Western Blot或磁珠法检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用，所述间充质干细胞外泌体来源于脂肪，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)脂肪来源间充质干细胞的制备：小鼠AMSC和成人AMSC按常规方法分离，小鼠AMSC用含5％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，成人AMSC采用含2％MSC培养无血清替代物的MSC培养基进行培养，AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞用于后续实验；(2)AMSC-Exo分离：上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并做第一次离心，取上清后第二次离心，再次取上清进行第三次离心，弃沉淀，将上清于100,000g离心70分钟，收集沉淀用PBS重悬后，再次离心100,000g，70分钟，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞外泌体；(3)脂肪来源间充质干细胞外泌体鉴定：通过NTA法分析其粒径，范围在64.5-143.8nm。并采用WesternBlot或磁珠法检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用，其特征在于，第一次离心为4℃，300g，10分钟，第二次离心为4℃，2000g，10分钟，第三次离心为4℃，10,000g，30分钟。3.一种间充质干细胞外泌体在制备促进线粒体自噬制剂中的应用，其特征在于，所述线粒体自噬，涉及的相关疾病包括但不限于急慢性肝损伤、肝炎、肝衰竭、肝纤维化/肝硬化、肝硬化，其中肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。4.一种提高AMSC-Exo促线粒体自噬效能的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)构建及制备SEQ:NO.1荷载的AMSC-Exo：(a)采用权利要求1所述方法制备AMSC-Exo；(b)采用电转法导入SEQ:NO.1核酸片段：将AMSC-Exo和SEQ:NO.1核酸在4℃的电穿孔缓冲液中轻轻混合，以0.4cm的电穿孔试管，在350V和150μF的电压下采用基因脉冲II电转仪进行电穿孔，将混合物在37℃下放置30分钟，以确保AMSC-Exo膜完全恢复，荷载后的AMSC-Exo以预冷的PBS清洗2次以去除未载入的多余核酸序列；(2)构建及制备X非活性特异性转录物片段修饰的AMSC-Exo：(a)构建X非活性特异性转录物修饰的AMSC：X非活性特异性转录物慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-XIST感染AMSC，表达质粒包含部分X非活性特异性转录物目的片段序列如SEQ:NO.2所示，对特定ceRNA功能区进行选择性拼接后的片段SEQ:NO.2；AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳宁，楼国华，郑敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33