一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1‑(linker a)n1‑loop2‑(linker b)n2‑loop3‑(linker b)n3‑loop4‑(linker a)n4‑loop1‑(linker a)n5‑loop2‑(linker b)n6‑loop3‑(linker b)n7‑loop4。本发明专利技术还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明专利技术的重组蛋白Vo可用于诊断试剂、预防或治疗性药物的制备，具有良好的抗E.coli K1感染的免疫保护效果。

A Recombinant Protein Vo and Its Preparation and Application

The present invention provides a recombinant protein Vo, which is fused by an extramembrane fragment of the outer membrane protein A (OmpA) of E. meningitis K1 through a ligapeptide fusion; the recombinant protein Vo has the following general formula: loop1 (linker a) N1 N1 loop2 (linker b) N2 loop3 loop3 (linker b) N3 loop4 (a) N4 loop4 loop1 (p1 (linker a) linker a) N2 linlinker b) N6 loop 3 (l) Inker b) N7 loop4. The invention also provides a preparation method and application of the recombinant protein. The recombinant protein Vo of the invention can be used for the preparation of diagnostic reagents, preventive or therapeutic drugs, and has good immune protection effect against E.coli K1 infection.

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术制药领域，涉及一种重组脑膜炎大肠杆菌K1疫苗蛋白Vo，本专利技术进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
细菌性脑膜炎是新生儿的常见感染性疾病，是新生儿死亡及远期致残的主要原因。世界卫生组织数据显示，新生儿细菌性脑膜炎发生率位于新生儿感染性疾病的前5位，其死亡率高达40％。由于早产儿的增多及其它原因，我国新生儿细菌性脑膜炎发病率逐渐上升，其已成为新生儿住院三大病因之一。随着抗生素耐药性的泛滥，新生儿细菌性脑膜炎的疗效和预后更加不容乐观。资料显示约有1％-40％的新生儿细菌性脑膜炎患者死亡，仅30％的患者能够治愈。患者治愈后通常出现神经系统后遗症，如脑积水、癫痫、智能低下等，为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1(E.coliK1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体，约超过80％病例的由该菌感染所致。外膜蛋白A(outermembraneA，OmpA)是E.coliK1的关键致病因子，在E.coliK1引发的新生儿脑膜炎中发挥重要作用(KimK.S.2008.NatRevMicrobiol6：625-634.)。研究发现，E.coliK1引起新生儿脑膜炎必须通过以下4个病理过程：①E.coliK1感染宿主并定植新生儿肠道或泌尿道；②E.coliK1从感染定植部位入血并在血液中繁殖，引起新生儿菌血症；③E.coliK1突破新生儿血脑屏障，进入中枢神经系统；④E.coliK1在颅内释放促炎因子和毒素，引起白细胞的浸润和血脑屏障通透性增加，最终引发新生儿脑膜炎等感染性疾病。在整个新生儿脑膜炎的发病过程中，E.coliK1能抵抗血液免疫系统的杀伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染是决定细菌感染的关键因素，而外膜蛋白A(outermembraneproteinA，OmpA)在此细菌致病的关键过程中都发挥决定性的作用(KrishnanS.，andN.V.Prasadarao.2012.FEBSJ.)，所以OmpA可以作为脑膜炎大肠杆菌疫苗的重要候选疫苗分子。OmpA为I型跨膜蛋白，其全长346个氨基酸，主要由2个domain组成，N端1-198氨基酸为典型的beta-barrel的跨膜结构，C端domain为肽聚糖结合结构域。重组表达的全长OmpA蛋白因为含有跨膜结构难溶于水，不能作为疫苗分子。OmpA的N端结构域是其主要功能结构域，其暴露在胞外的loop1，loop2，loop3，loop4是其介导OmpA相关病理生理过程的关键结构域。此外，通过AntiJen，Bepipred和Epitome等表位软件预测发现OmpA的loop1，loop2，loop3，loop4具有很多的B细胞表位和T细胞表位。目前尚没有基于OmpA蛋白制备抗体的报道。
技术实现思路
针对脑膜炎大肠杆菌的严重危害，本专利技术提供一种脑膜炎大肠杆菌K1的重组蛋白Vo，该重组蛋白由脑膜炎大肠杆菌K1OmpA的有效成分构成，其可应用于制备脑膜炎大肠杆菌的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案：一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linkera)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4；其中，所述连接肽linkera选自GlySerGlyGlySer，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySer；所述连接肽linkerb选自GlySerGlyGlySerGly，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySerGly；n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选自1、2、3或4，优选为1；优选地，所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO：3；优选地，所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO：4。优选地，所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO：5；优选地，所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO：6。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述重组蛋白Vo的氨基酸序列为SEQIDNO：2；优选地，编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQIDNO：1。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体；优选为pGex-6P-2。进一步地，本专利技术提供了上述重组蛋白Vo的制备方法，所述方法包括：1)构建如上所述的表达载体；2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌，得到含有表达载体的宿主菌；3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo；4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种，优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue菌株。进一步地，本专利技术提供了上述重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的药物中的应用。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述药物为用于诊断脑膜炎大肠杆菌K1的试剂盒。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述药物为用于预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的亚单位疫苗。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：1)用于表达重组蛋白Vo的表达质粒可在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达。2)选择pGEX载体系列时，重组蛋白Vo以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的重组蛋白Vo的纯度大于95％。3)Vo重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果。利用本专利技术的重组蛋白Vo制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗E.coliK1感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。附图说明图1：重组蛋白Vo的结构组成示意图。A为OmpA分子的结构示意图。B为重组蛋白Vo的结构示意图。图2为重组质粒pGex-6P-2-Vo的双酶切鉴定结果。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2&3：重组表达质粒pGEX-6p-2-Vo经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约500bp。图3为蛋白Vo诱导鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白Vo，其特征在于，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1‑(linker a)n1‑loop2‑(linker b)n2‑loop3‑(linker b)n3‑loop4‑(linker a)n4‑loop1‑(linker a)n5‑loop2‑(linker b)n6‑loop3‑(linker b)n7‑loop4；其中，所述连接肽linker a为GlySerGlyGlySer；所述连接肽linkerb为GlySerGlyGlySerGly；n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选为1；所述loop1的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述loop2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述loop3的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述loop4的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白Vo，其特征在于，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linkera)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4；其中，所述连接肽linkera为GlySerGlyGlySer；所述连接肽linkerb为GlySerGlyGlySerGly；n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选为1；所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO:3，所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO:4，所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO:5，所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO:6。2.如权利要求1所述的重组蛋白Vo，其特征在于，编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQIDNO:1。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码权利要求1或2所述的重组蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾江，魏超，顾浩，赵莉群，杨峰，高晨，敬海明，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50