检测罕见序列变体的组合物和方法技术

在一些方面，本公开内容提供了用于鉴定核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，方法包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，以及将出现在至少两种不同的环状多核苷酸例如具有不同接点的两种环状多核苷酸中，或出现在两种不同的剪切多核苷酸中的序列差异判定为序列变体。在一些方面，本公开内容提供了可用于所述方法的组合物和系统。

Compositions and methods for detecting rare sequence variants

In some respects, the present disclosure provides methods for identifying sequence variants in nucleic acid samples. In some implementations, methods include identifying sequence differences between sequencing reads and reference sequences, and identifying sequence variations that occur in at least two different cyclic polynucleotides, such as two cyclic polynucleotides with different junctions, or in two different shear polynucleotides. In some respects, the present disclosure provides compositions and systems that can be used for the said method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测罕见序列变体的组合物和方法交叉引用本申请要求于2016年8月15日提交的美国临时专利申请号62/375,396的权益，该临时申请通过引用以其全文并入于此用于所有目的。
技术介绍
在复杂群体内鉴定序列变异是一个正在蓬勃发展的领域，特别是随着大规模平行核酸测序技术的出现。然而，由于常用技术的固有误差频率比群体内许多实际序列变异的频率更大，大规模平行测序具有显著的局限性。例如，在标准的高通量测序中已报道了0.1-1％的误差率。当变体频率低，如等于或低于该误差率时，对罕见序列变体的检测具有高的假阳性率。经常存在检测罕见序列变体的迫切需要。例如，检测罕见特征性序列可用于鉴定和区分有害环境污染物如细菌分类群的存在。表征细菌分类群的一种常见方法是鉴定高度保守序列如rRNA序列的差异。然而，迄今为止典型的基于测序的方法面临与给定样品中不同基因组的绝对数量和成员之间的同源性程度相关的挑战，从而为本已繁琐的方法带来复杂的问题。改进的方法将会有在各种情境下增强污染检测的潜力。例如，可以用本系统和方法来调查用于组装卫星和其他航天器组件的洁净室，以了解存在哪些微生物群落，并开发更好的去污和清洁技术来防止将陆地微生物引入其他行星或其样品中，或开发用于将假定的外星微生物所产生的数据与污染陆地微生物所产生的数据相区分的方法。食品监测应用包括针对食源性病原体定期检测食品加工厂的生产线，调查屠宰场，检查餐馆、医院、学校、惩教设施和其他机构的厨房和食品储存区。还可以类似地监测水储备和加工厂。罕见变体检测对于病理性突变的早期检测也可能很重要。例如，在临床样品中检测癌症相关的点突变可以改善化疗期间极少残留疾病的鉴定，并检测复发患者的肿瘤细胞的出现。罕见点突变的检测对于评估环境诱变剂的暴露、监测内源性DNA修复以及研究衰老个体中体细胞突变的积累也很重要。此外，更灵敏的检测罕见变体的方法可以增强产前诊断，能够实现对母体血液中存在的胎儿细胞的表征。
技术实现思路
鉴于前述内容，存在对检测罕见序列变体的改进方法的需求。本公开内容的组合物和方法满足了该需求，并且还提供了另外的益处。特别地，本公开内容的各个方面提供对罕见或低频核酸序列变体(有时称为突变)的高灵敏度检测。这包括在可能含有在正常序列背景下的少量变异序列的样品中鉴定和阐明低频核酸变异(包括置换、插入和缺失)，以及在测序错误背景下鉴定低频变异。在一方面，本公开内容提供了进行滚环扩增的方法，该方法包括(a)使用连接酶将多种多核苷酸中的个体多核苷酸环化，以形成多种环状多核苷酸，其中多种多核苷酸中的每种多核苷酸在连接前具有5’端和3’端；(b)将连接酶降解；(c)在将连接酶降解后扩增环状多核苷酸，以产生扩增的多核苷酸；其中不在步骤(a)与(c)之间纯化或分离多核苷酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(a)与(c)之间将线性多核苷酸降解。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含单链多核苷酸。在一些实施方案中，个体环状多核苷酸具有接点，该接点在环化的多核苷酸中各不相同。在一些实施方案中，环化包括将衔接子多核苷酸接合至多种多核苷酸中的多核苷酸的5’端、3’端或5’端和3’端二者的步骤。在一些实施方案中，扩增包括使环状多核苷酸经受包含随机引物的扩增反应混合物。在一些实施方案中，扩增包括使环状多核苷酸经受包含一种或多种引物的扩增反应混合物，每种引物通过序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。在一些实施方案中，样品是来自受试者的样品。在一些实施方案中，样品是尿液、粪便、血液、唾液、组织或体液。在一些实施方案中，样品包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于判定步骤来诊断和任选地治疗所述受试者。在一些实施方案中，序列变体是因果遗传变体。在一些实施方案中，序列变体与癌症的类型或阶段相关。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含无细胞多核苷酸。在一些实施方案中，无细胞多核苷酸包含循环肿瘤DNA。在一些实施方案中，无细胞多核苷酸包含循环肿瘤RNA。在一些实施方案中，该方法进一步包括对扩增的多核苷酸进行测序，以产生多个测序读取。在一些实施方案中，该方法进一步包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异。在一些实施方案中，该方法进一步包括仅在以下情况下才将序列差异判定为多种多核苷酸中的序列变体：(i)在双链输入分子的两条链上都鉴定到序列差异；(ii)序列差异出现在通过滚环扩增形成的多联体的共有序列中；和/或(iii)序列差异出现在两种不同的分子中。在一些实施方案中，当序列差异出现在具有在5’端与3’端之间形成的不同接点的至少两种环状多核苷酸中时，序列差异被鉴定为出现在两种不同分子中。在一些实施方案中，当对应于两种不同分子的读取具有不同的5’端和不同的3’端时，序列差异被鉴定为出现在两种不同的分子中。在另一方面，本公开内容提供了鉴定包含多种多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，多种多核苷酸中的每种多核苷酸具有5’端和3’端，该方法包括：(a)环化多种多核苷酸中的个体多核苷酸以形成多种环状多核苷酸，每种环状多核苷酸在5’端与3’端之间具有接点；(b)扩增(a)的环状多核苷酸以产生扩增的多核苷酸；(c)将扩增的多核苷酸剪切以产生剪切的多核苷酸，每个剪切的多核苷酸包含在5’端和/或3’端处的一个或多个剪切点；(d)对剪切的多核苷酸进行测序，以产生多个测序读取；(e)鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异；以及(f)当序列差异出现在至少两种不同的剪切多核苷酸中时，将序列差异判定为序列变体。在一些实施方案中，当(i)序列差异出现在具有不同接点的至少两种环状多核苷酸中；(ii)在双链输入分子的两条链上都鉴定到序列差异；和/或(iii)序列差异出现在由包括滚环扩增在内的扩增形成的多联体的共有序列中时，进一步出现将序列差异判定为序列变体。在一些实施方案中，多种多核苷酸包含单链多核苷酸。在一些实施方案中，通过使多种多核苷酸经受连接反应来实现环化。在一些实施方案中，序列变体是单核苷酸多态性。在一些实施方案中，参考序列是通过将测序读取彼此比对而形成的共有序列。在一些实施方案中，参考序列是测序读取。在一些实施方案中，环化包括将衔接子多核苷酸接合至多种多核苷酸中的多核苷酸的5’端、3’端或5’端和3’端二者的步骤。在一些实施方案中，通过使用具有链置换活性的聚合酶实现扩增。在一些实施方案中，扩增包括使环状多核苷酸经受包含随机引物的扩增反应混合物。在一些实施方案中，扩增包括使环状多核苷酸经受包含一种或多种引物的扩增反应混合物，每种引物通过序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。在一些实施方案中，在未富集的情况下使扩增的多核苷酸经受测序步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过在测序之前进行富集步骤来富集扩增的多核苷酸中的一种或多种靶多核苷酸。在一些实施方案中，基于判定步骤鉴定微生物污染物。在一些实施方案中，样品是来自受试者的样品。在一些实施方案中，样品是尿液、粪便、血液、唾液、组织或体液。在一些实施方案中，样品包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于判定步骤来诊断和任选地治疗所述受试者。在一些实施方案中，序列变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种进行滚环扩增的方法，所述方法包括：(a)使用连接酶将多种多核苷酸中的个体多核苷酸环化，以形成多种环状多核苷酸，其中所述多种多核苷酸中的每种多核苷酸在连接前具有5’端和3’端；(b)将所述连接酶降解；以及(c)在将所述连接酶降解后扩增所述环状多核苷酸，以产生扩增的多核苷酸；其中不在步骤(a)与(c)之间纯化或分离多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.15 US 62/375,3961.一种进行滚环扩增的方法，所述方法包括：(a)使用连接酶将多种多核苷酸中的个体多核苷酸环化，以形成多种环状多核苷酸，其中所述多种多核苷酸中的每种多核苷酸在连接前具有5’端和3’端；(b)将所述连接酶降解；以及(c)在将所述连接酶降解后扩增所述环状多核苷酸，以产生扩增的多核苷酸；其中不在步骤(a)与(c)之间纯化或分离多核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(a)与(c)之间将线性多核苷酸降解。3.如权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸为单链。4.如权利要求1所述的方法，其中个体环状多核苷酸具有接点，所述接点在环化的多核苷酸中各不相同。5.如权利要求1所述的方法，其中环化包括将衔接子多核苷酸接合至所述多种多核苷酸中的多核苷酸的5’端、3’端或5’端和3’端二者的步骤。6.如权利要求1所述的方法，其中扩增包括使所述环状多核苷酸经历包含随机引物的扩增反应混合物。7.如权利要求1所述的方法，其中扩增包括使所述环状多核苷酸经历包含一种或多种引物的扩增反应混合物，每种所述引物均通过序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。8.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是来自受试者的样品。9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品是尿液、粪便、血液、唾液、组织或体液。10.如权利要求8所述的方法，其中所述样品包含肿瘤细胞。11.如权利要求8所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品。12.如权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述判定步骤来诊断和任选地治疗所述受试者。13.如权利要求1所述的方法，其中所述序列变体是因果遗传变体。14.如权利要求1所述的方法，其中所述序列变体与癌症的类型或阶段相关。15.如权利要求1所述的方法，其中所述多种多核苷酸包含无细胞多核苷酸。16.如权利要求15所述的方法，其中所述无细胞多核苷酸包含循环肿瘤DNA。17.如权利要求1所述的方法，其进一步包括对所述扩增的多核苷酸进行测序，以产生多个测序读取。18.如权利要求17所述的方法，其进一步包括鉴定所述测序读取与参考序列之间的序列差异。19.如权利要求18所述的方法，其进一步包括仅在以下情况下才将序列差异判定为所述多种多核苷酸中的序列变体：(i)在双链输入分子的两条链上都鉴定到所述序列差异；(ii)所述序列差异出现在通过滚环扩增形成的多联体的共有序列中；和/或(iii)所述序列差异出现在两种不同的分子中。20.如权利要求19所述的方法，其中当所述序列差异出现在具有在5’端与3’端之间形成的不同接点的至少两种环状多核苷酸中时，序列差异被鉴定为出现在两种不同的分子中。21.如权利要求19或20所述的方法，其中当对应于所述两种不同分子的读取具有不同的5’端和不同的3’端时，序列差异被鉴定为出现在两种不同的分子中。22.如权利要求1所述的方法，其进一步包括剪切所述扩增的核苷酸。23.一种鉴定包含多种多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，所述多种多核苷酸中的每种多核苷酸具有5’端和3’端，所述方法包括：(a)将所述多种多核苷酸中的个体多核苷酸环化以形成多种环状多核苷酸，每种环状多核苷酸在5’端与3’端之间具有接点；(b)扩增(a)的所述环状多核苷酸以产生扩增的多核苷酸；(c)将所述扩增的多核苷酸剪切以产生剪切的多核苷酸，每种剪切的多核苷酸包含在5’端和/或3’端处的一个或多个剪切点；(d)对所述剪切的多核苷酸进行测序，以产生多个测序读取；(e)鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异；以及(f)当序列差异出现在至少两种不同的剪切多核苷酸中时，将所述序列差异判定为所述序列变体。24.如权利要求23所述的方法，其中当(i)所述序列差异出现在具有不同接点的至少两种环状多核苷酸中；(ii)在双链输入分子的两条链上都鉴定到所述序列差异；和/或(iii)所述序列差异出现在由包括滚环扩增在内的扩增形成的多联体的共有序列中时，进一步出现将所述序列差异判定为所述序列变体。25.如权利要求23所述的方法，其中所述多种多核苷酸为单链。26.如权利要求23所述的方法，其中通过使所述多种多核苷酸经历连接反应来实现环化。27.如权利要求23所述的方法，其中所述序列变体是单核苷酸多态性。28.如权利要求23所述的方法，其中所述参考序列是通过将所述测序读取彼此比对而形成的共有序列。29.如权利要求23所述的方法，其中所述参考序列是测序读取。30.如权利要求23所述的方法，其中环化包括将衔接子多核苷酸接合至所述多种多核苷酸中的多核苷酸的5’端、3’端或5’端和3’端二者的步骤。31.如权利要求23所述的方法，其中通过使用具有链置换活性的聚合酶实现扩增。32.如权利要求23所述的方法，其中扩增包括使所述环状多核苷酸经历包含随机引物的扩增反应混合物。33.如权利要求23所述的方法，其中扩增包括使所述环状多核苷酸经历包含一种或多种引物的扩增反应混合物，每种所述引物均通过序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。34.如权利要求23所述的方法，其中在未富集的情况下使所述扩增的多核苷酸经历所述测序步骤。35.如权利要求23所述的方法，其进一步包括通过在测序之前进行富集步骤来富集所述扩增的多核苷酸中的一种或多种靶多核苷酸。36.如权利要求23所述的方法，其中基于所述判定步骤鉴定微生物污染物。37.如权利要求23所述的方法，其中所述样品是来自受试者的样品。38.如权利要求37所述的方法，其中所述样品是尿液、粪便、血液、唾液、组织或体液。39.如权利要求37所述的方法，其中所述样品包含肿瘤细胞。40.如权利要求37所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品。41.如权利要求37所述的方法，其进一步包括基于所述判定步骤来诊断和任选地治疗所述受试者。42.如权利要求23所述的方法，其中所述序列变体是因果遗传变体。43.如权利要求23所述的方法，其中所述序列变体与癌症的类型或阶段相关。44.如权利要求23所述的方法，其中所述多种多核苷酸包含无细胞多核苷酸。45.如权利要求44所述的方法，其中所述无细胞多核苷酸包含循环肿瘤DNA。46.一种用于进行如权利要求1至43中任一项所述的方法的反应混合物，其中所述反应混合物包含(a)多种多联体，其中所述多种多联体中的个体多联体包含通过将具有5’端和3’端的个体多核苷酸环化而形成的不同接点；(b)包含序列A’的第一引物，其中所述第一引物通过序列A与序列A’之间的序列互补性与靶序列的序列A特异性杂交；(c)包含序列B的第二引物，其中所述第二引物通过B与B’之间的序列互补性与包含所述靶序列的互补序列的互补多核苷酸中存在的序列B’特异性杂交；以及(d)使所述第一引物和所述第二引物延伸以产生扩增的多核苷酸的聚合酶；其中所述靶序列中序列A的5’端与序列B的3’端之间的距离为75nt或更小。47.如权利要求46所述的反应混合物，其中所述第一引物包含在序列A’的5’侧的序列C，所述第二引物包含在序列B的5’侧的序列D，并且在扩增反应中的第一扩增步骤期间，序列C和序列D均不与两种或更多种多联体杂交。48.一种用于检测序列变体的系统，其包含(a)计算机，所述计算机被配置用于接收关于对样品进行检测反应的用户请求；(b)扩增系统，所述扩增系统响应于所述用户请求，对所述样品或其部分进行核酸扩增反应，其中所述扩增反应包括以下步骤：(i)使用连接酶将多种多核苷酸中的个体多核苷酸环化，以形成多种环状多核苷酸，其中所述多种多核苷酸中的每种多核苷酸在连接前具有5’端和3’端；(ii)将所述连接酶降解；以及(iii)在将所述连接酶降解后扩增所述环状多核苷酸，以产生扩增的多核苷酸；其中不在步骤(i)与(iii)之间纯化或分离多核苷酸；(c)测序系统，所述测序系统产生由所述扩增系统扩增的多核苷酸的测序读取，鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，并将出现在具有不同接点的至少两种环状多核苷酸中的序列差异判定为所述序列变体；以及(d)报告生成器，所述报告生成器向接收者发送报告，其中所述报告包含所述序列变体的检测结果。49.如权利要求48所述的系统，其中所述接收者是所述用户。50.一种包含代码的计算机可读介质，所述代码在由一个或多个处...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙朝辉，翁莉，林盛榕，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY