CRISPR/CAS related methods, compositions and components for editing target nucleic acid sequences or regulating the expression of target nucleic acid sequences are provided, as well as their application in combination with cancer immunotherapy for adoptive metastasis including engineered T cells or T cell precursors.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因工程化细胞及其制备方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年5月6日提交的题为“GeneticallyEngineeredCellsAndMethodsOfMakingTheSame[基因工程化细胞及其制备方法]”的美国临时申请号62/333,144和2016年5月6日提交的题为“CRISPR-CAS-RelatedMethods,CompositionsAndComponentsForCancerImmunotherapy[用于癌症免疫疗法的CRISPR-CAS相关方法、组合物和组分]”的美国临时申请号62/332,657的优先权，将其各自的内容通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表被提供为题为735042006440SEQLIST.TXT的文件，创建于2017年5月4日，大小是12,031,926个字节。序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入。
本披露涉及用于编辑靶核酸序列或调节靶核酸序列表达的CRISPR/CAS相关方法、组合物和组分，及其与包括工程化T细胞或T细胞前体的过继转移的癌症免疫疗法结合的应用。
技术介绍
有多种策略可用于产生和给予工程化细胞用于过继疗法。例如，策略可用于工程化表达基因工程化抗原受体(例如CAR)的免疫细胞，以及用于在细胞中阻抑或阻遏基因表达。需要改善的策略来改善细胞的功效，例如通过在给予受试者时避免效应物功能的阻抑以及改善细胞的活性和/或存活。提供了满足此类需求的方法、细胞、组合物、试剂盒和系统。
技术实现思路
提供了组合物，这些组合物包括含有重组受体的工程化免疫细胞和能...
【技术保护点】
1.一种组合物，该组合物包含(a)工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含特异性结合抗原的重组受体；和(b)能够诱导编码PD‑1多肽的PDCD1基因的遗传破坏的剂，其中所述剂能够在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的细胞中，和/或在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的表达该重组受体的细胞中诱导所述遗传破坏，和/或预防或减少PD‑1表达。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.06 US 62/333,144;2016.05.06 US 62/332,6571.一种组合物，该组合物包含(a)工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含特异性结合抗原的重组受体；和(b)能够诱导编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏的剂，其中所述剂能够在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的细胞中，和/或在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的表达该重组受体的细胞中诱导所述遗传破坏，和/或预防或减少PD-1表达。2.一种组合物，该组合物包含(a)工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含编码特异性结合抗原的重组受体的核酸；和(b)能够诱导编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏的剂，其中所述剂能够在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的细胞中，和/或在该组合物中至少70％、至少75％、至少80％、或至少或大于90％的表达该重组受体的细胞中诱导所述遗传破坏，和/或预防或减少PD-1表达。3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中该工程化免疫细胞在其表面上表达该重组受体。4.一种组合物，该组合物包含含有工程化免疫细胞的细胞群体，该工程化免疫细胞包含(a)特异性结合抗原的重组受体；和(b)编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏，所述遗传破坏预防或减少所述PD-1多肽的表达，其中：在该组合物中至少约70％、至少约75％、或至少约80％或至少或大于约90％的细胞含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因，不含PDCD1基因，和/或不含功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；和/或在该组合物中至少约70％、至少约75％、或至少约80％或至少或大于约90％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，和/或不表达PD-1多肽。5.一种组合物，该组合物包含含有工程化免疫细胞的细胞群体，该工程化免疫细胞包含(a)特异性结合抗原的重组受体，其中在该重组受体与所述抗原结合时，该工程化免疫细胞能够诱导细胞毒性、增殖和/或分泌细胞因子；和(b)编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏，所述遗传破坏能够预防或减少所述PD-1多肽的表达，任选地其中所述预防或减少是在该组合物中至少或至少约或大于或大于约70％、75％、80％、85％或90％的细胞中和/或在该组合物中至少或至少约或大于或大于约70％、75％、80％、85％或90％的表达该重组受体的细胞中。6.一种组合物，该组合物包含含有工程化免疫细胞群体的细胞群体，每个工程化免疫细胞包含(a)特异性结合抗原的重组受体；和(b)编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏，其中所述遗传破坏能够预防或减少所述PD-1多肽的表达，其中：平均而言，分别与该组合物中包含该重组受体且不包含该遗传破坏的其他细胞中所述重组受体的平均表达和/或表面表达水平相比，这些工程化免疫细胞以相同、大致相同或基本相同的水平表现出该受体的表达和/或表面表达，或这些工程化免疫细胞不表达该PD-1多肽，并且平均而言，分别与该组合物中包含该重组受体且表达该PD-1多肽的细胞中的平均表达和/或表面水平相比，这些工程化免疫细胞以相同、大致相同或基本相同的水平表现出该受体的表达和/或表面表达。7.如权利要求1-4和6中任一项所述的组合物，其中任选地如在体外测定中所测量的，任选地在任选地包括任选地在一种或多种细胞因子的存在下孵育12、24、36、48或60小时的体外测定中，在与该抗原、表达该抗原的细胞和/或抗原受体活化物质一起孵育时，该重组受体能够特异性结合该抗原，能够活化或刺激工程化T细胞，能够诱导细胞毒性，或能够诱导该免疫细胞的增殖、存活和/或细胞因子分泌。8.如权利要求1-4、6和7中任一项所述的组合物，其中任选地如在体外测定中所测量的，该体外测定任选地包括任选地在一种或多种细胞因子的存在下孵育12、24、36、48或60小时且任选地包括或不包括将该免疫细胞暴露于表达PD-L1的细胞，在与该抗原、表达该抗原的细胞和/或抗原受体活化物质一起孵育时，该工程化免疫细胞能够特异性结合该抗原，能够诱导细胞毒性、增殖、存活和/或分泌细胞因子。9.如权利要求7或权利要求8所述的组合物，其中：当在相同条件下评估时，该结合、细胞毒性、增殖、存活或细胞因子分泌的水平或程度或范围或持续时间与针对包含该重组受体但不包含PDCD1基因的该遗传破坏的免疫细胞检测到或观察到的相比相同、大致相同或基本相同。10.如权利要求6和8-9中任一项所述的组合物，其中该结合、细胞毒性、增殖、存活和/或细胞因子分泌是在抽出并再次暴露于该抗原、抗原表达细胞和/或物质后如任选地在体外测定中所测量的。11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中该免疫细胞是来自受试者的原代细胞。12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中该免疫细胞是人细胞。13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中该免疫细胞是白细胞。14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中该免疫细胞是NK细胞或T细胞。15.如权利要求14所述的组合物，其中该免疫细胞包含含有未分级的T细胞的多种T细胞，包含分离的CD8+细胞或针对CD8+T细胞进行富集，或包含分离的CD4+T细胞或针对CD4+细胞进行富集，和/或针对其子集进行富集，该子集选自下组，该组由以下组成：原初细胞、效应记忆细胞、中枢记忆细胞、干中枢记忆细胞、效应记忆细胞和长寿效应记忆细胞。16.如权利要求14或权利要求15所述的组合物，其中表现出非活化的长寿记忆或中枢记忆表型的T细胞、或表达该受体且包含该遗传破坏的T细胞在该组合物中的百分比与如下细胞群体相同或基本相同，该细胞群体与该组合物相同或基本相同但不含该遗传破坏或但不表达该PD-1多肽。17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中当在相同条件下评估时，任选地在不存在或存在使该免疫细胞接触或暴露于PD-L1的情况下进行比较，表现出非活化的长寿记忆或中枢记忆表型的T细胞在该组合物中的百分比与表现出该表型的T细胞在包含含有该重组受体但不含编码PD-1多肽的PDCD1基因的该遗传破坏的T细胞的组合物中的百分比相比相同、大致相同或基本相同。18.如权利要求16或权利要求17所述的组合物，其中该表型是如将该组合物在或在约37℃±2℃下孵育至少12小时、24小时、48小时、96小时、6天、12天、24天、36天、48天或60天后所评估的。19.如权利要求18所述的组合物，其中该孵育是体外的。20.如权利要求18或权利要求19所述的组合物，其中该孵育的至少一部分是在刺激剂的存在下进行的，该孵育的至少一部分是任选地长达1小时、6小时、24小时或48小时的孵育。21.如权利要求20所述的组合物，其中该刺激剂是能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的剂。22.如权利要求20或权利要求21所述的组合物，其中该刺激剂是或包含对CD3具有特异性的抗体、对CD28具有特异性的抗体和/或细胞因子。23.如权利要求16-22中任一项所述的组合物，其中包含该重组受体的T细胞包含一种或多种选自以下的表型标记：CCR7+、4-1BB+(CD137+)、TIM3+、CD27+、CD62L+、CD127+、CD45RA+、CD45RO-、t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+或LFA-1+。24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中该重组受体是功能性非TCR抗原受体或转基因TCR。25.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中该重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。26.如权利要求25所述的组合物，其中该CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是抗体或抗体片段。27.如权利要求26所述的组合物，其中该抗体片段是单链片段。28.如权利要求26或权利要求27所述的组合物，其中该抗体片段包含通过柔性免疫球蛋白接头连接的抗体可变区。29.如权利要求26-28中任一项所述的组合物，其中该片段包含scFv。30.如权利要求1-29中任一项所述的组合物，其中该抗原与疾病或障碍相关联。31.如权利要求30所述的组合物，其中该疾病或障碍是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或肿瘤或癌症。32.如权利要求1-31中任一项所述的组合物，其中该重组受体特异性结合肿瘤抗原。33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中该抗原选自ROR1、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、LewisY、L1-细胞黏附分子(CD171)、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、瘤胚抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGEA3、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、周期蛋白A1(CCNA1)、BCMA和白细胞介素12。34.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，其中该重组受体包含含有ITAM的细胞内信号传导结构域。35.如权利要求34所述的组合物，其中该细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内结构域。36.如权利要求34或权利要求35所述的组合物，其中该重组受体进一步包含共刺激信号传导区。37.如权利要求36所述的组合物，其中该共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB的信号传导结构域。38.如权利要求1-3和7-37中任一项所述的组合物，其中该剂包含以下中的至少一种：(a)具有与PDCD1基因的靶结构域互补的靶向结构域的至少一种gRNA，或(b)编码该至少一种gRNA的至少一种核酸。39.如权利要求1-3和7-38中任一项所述的组合物，其中该剂包含至少一种Cas9分子和gRNA的复合物，该gRNA具有与PDCD1基因的靶结构域互补的靶向结构域。40.如权利要求38或权利要求39所述的组合物，其中该指导RNA进一步包含第一互补结构域、与该第一互补结构域互补的第二互补结构域、近端结构域和任选地尾结构域。41.如权利要求40所述的组合物，其中该第一互补结构域和第二互补结构域通过连接结构域连接。42.如权利要求41中任一项所述的组合物，其中该指导RNA包含3'聚-A尾和5'抗反向帽类似物(ARCA)帽。43.如权利要求39-42中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是酶促活性Cas9。44.如权利要求38-43中任一项所述的组合物，其中该至少一种gRNA包括靶向结构域，该靶向结构域包含选自下组的序列，该组由以下组成：GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQIDNO:508)、GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQIDNO:514)、CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQIDNO:1533)、UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQIDNO:579)、CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQIDNO:582)和CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQIDNO:723)。45.如权利要求38-44中任一项所述的组合物，其中该至少一种gRNA包括靶向结构域，该靶向结构域包含序列CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQIDNO:582)。46.如权利要求38-45中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是切口酶，并且两种Cas9分子/gRNA分子复合物由两种不同的gRNA分子指导，以在该靶结构域的相对链上以两个单链断裂来切割该靶结构域。47.如权利要求39-46中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9分子。48.如权利要求39-46中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是化脓性链球菌Cas9。49.如权利要求39-48中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子缺乏活性RuvC结构域或活性HNH结构域。50.如权利要求39-46、48和49中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是包含D10A突变的化脓性链球菌Cas9分子。51.如权利要求46-50中任一项所述的组合物，其中该两种gRNA分子包含选自以下靶向结构域对的靶向结构域：52.如权利要求39-46和48-51中任一项所述的组合物，其中该Cas9分子是包含N863A突变的化脓性链球菌Cas9分子。53.如权利要求52所述的组合物，其中该两种gRNA分子包含选自以下靶向结构域对的靶向结构域：54.如权利要求1-53中任一项所述的组合物，其中该遗传破坏包括双链断裂的产生，该双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)修复以实现该PDCD1基因中的插入和缺失(indel)。55.如权利要求1-54中任一项所述的组合物，其中：在该组合物中至少约70％、至少约75％、或至少约80％的细胞含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；和/或在该组合物中至少约70％、至少约75％、或至少约80％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，或不表达PD-1多肽。56.如权利要求4或权利要求55所述的组合物，其中：在该组合物中大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的细胞含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；和/或在该组合物中大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，和/或不表达PD-1多肽。57.如权利要求1-56中任一项所述的组合物，其中：任选地如通过流式细胞术所评估的，在该组合物中至少或至少约90％的细胞、或在该组合物中至少或至少约90％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽。58.如权利要求1-57中任一项所述的组合物，其中基因组中该基因的两个等位基因都被破坏。59.如权利要求1-58中任一项所述的组合物，其中在该组合物中的细胞和/或在该组合物中的表达该重组受体的细胞没有针对含有该遗传破坏的细胞进行富集或选择；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽。60.如权利要求1-59中任一项所述的组合物，其中平均而言，在该组合物中的每个细胞中或在该组合物中的表达该重组受体的每个细胞中，不超过2个、不超过5个或不超过10个其他基因被破坏或被该剂破坏。61.如权利要求1-60中任一项所述的组合物，其中在该组合物中的每个细胞中或在该组合物中的表达该重组受体的每个细胞中，没有其他基因在该细胞中被破坏或被该剂破坏。62.如权利要求1-61中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含药学上可接受的缓冲剂。63.如权利要求1-62中任一项所述的组合物，其中，在将该组合物给予任选地患有该疾病或病症的受试者后的时间点：表达该重组受体且不表达PD-1的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的；含有该遗传破坏的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的；含有该遗传破坏且表达该重组受体的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的。64.如权利要求63所述的组合物，其中该时间点为或约为给予后7、8、9、10、11、12、13、或14天或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周。65.如权利要求63或64所述的组合物，其中在该血液或样品中可检测到的所述细胞以如下浓度或约如下浓度或至少如下浓度或至少约如下浓度存在：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或100个细胞/微升的血液，和/或代表在该血液中至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的T细胞。66.如权利要求1-65中任一项所述的组合物，其中在将该组合物给予受试者后：在该组合物中包含该遗传破坏的细胞在该受试者中以如下速率和/或持续如下时间来扩增和/或持续存在：该速率和/或时间与在该组合物中不含该遗传破坏的T细胞的扩增和/或持续性、和/或T细胞表达该重组受体但不包含该缺失的参考组合物的T细胞的扩增和/或持续性至少相同、任选地更大；和/或在该组合物中包含该遗传破坏且包含该重组受体的细胞在该受试者中以如下速率和/或持续如下时间来扩增和/或持续存在：该速率和/或时间与在该组合物中不含该遗传破坏的T细胞的扩增和/或持续性、和/或T细胞表达该重组受体但不包含该缺失的参考组合物的T细胞的扩增和/或持续性至少相同、任选地更大。67.如权利要求66所述的组合物，其中该速率或时间至少或至少约大1.5倍或2倍或3倍。68.一种产生基因工程化免疫细胞的方法，该方法包括：(a)向免疫细胞中引入编码特异性结合抗原的重组受体的核酸分子；以及(b)向该免疫细胞中引入能够诱导编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏的剂，该剂包含以下中的一种：(i)具有与该PDCD1基因的靶结构域互补的靶向结构域的至少一种gRNA或(ii)编码该至少一种gRNA的至少一种核酸。69.一种产生基因工程化免疫细胞的方法，该方法包括向表达特异性结合抗原的重组受体的免疫细胞中引入能够诱导编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏的剂，该剂包含以下中的一种：(i)具有与该PDCD1基因的靶结构域互补的靶向结构域的至少一种gRNA或(ii)编码该至少一种gRNA的至少一种核酸。70.如权利要求68或权利要求69所述的方法，其中该剂包含至少一种Cas9分子和gRNA的复合物，该gRNA具有与PDCD1基因的靶结构域互补的靶向结构域。71.如权利要求68-70中任一项所述的方法，其中该指导RNA进一步包含第一互补结构域、与该第一互补结构域互补的第二互补结构域、近端结构域和任选地尾结构域。72.如权利要求71所述的方法，其中该第一互补结构域和第二互补结构域通过连接结构域连接。73.如权利要求68-72中任一项所述的方法，其中该指导RNA包含3'聚-A尾和5'抗反向帽类似物(ARCA)帽。74.如权利要求68-73中任一项所述的方法，其中引入包括在体外使这些细胞与该剂或其一部分接触。75.如权利要求68-74中任一项所述的方法，其中该剂的引入包括电穿孔。76.如权利要求74或权利要求75所述的方法，其中该引入进一步包括在这些细胞与该剂接触之前、期间或之后，或在该电穿孔之前、期间或之后，在体外孵育这些细胞。77.如权利要求68-76中任一项所述的方法，其中(a)中的该引入包括转导，并且该引入进一步包括在该转导之前、期间或之后，在体外孵育这些细胞。78.如权利要求76或权利要求77所述的方法，其中该孵育的至少一部分是在如下的存在下：(i)选自由IL-2、IL-7和IL-15组成的组的细胞因子，和/或(ii)任选地包含抗CD3和/或抗CD28抗体的一种或多种刺激剂或活化剂。79.如权利要求77或权利要求78所述的方法，其中(a)中的该引入包括：在转导之前，将这些细胞与浓度为20U/mL至200U/mL、任选地约100U/mL的IL-2一起孵育；与浓度为1ng/mL至50ng/mL、任选地约10ng/mL的IL-7一起孵育，和/或与浓度为0.5ng/mL至20ng/mL、任选地约5ng/mL的IL-15一起孵育；以及在转导之后，将这些细胞与浓度为10U/mL至200U/mL、任选地约50U/mL的IL-2一起孵育；与浓度为0.5ng/mL至20ng/mL、任选地约5ng/mL的IL-7一起孵育，和/或与浓度为0.1ng/mL至10ng/mL、任选地约0.5ng/mL的IL-15一起孵育。80.如权利要求76-79中任一项所述的方法，其中该孵育独立地进行长达或大约24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。81.如权利要求76-80中任一项所述的方法，其中该孵育独立地进行24-48小时或36-48小时。82.如权利要求74-81中任一项所述的方法，其中使这些细胞与该剂以大约1微克/100,000、200,000、300,000、400,000、或500,000个细胞的比率接触。83.如权利要求76-82中任一项所述的方法，其中：该孵育处于30℃±2℃至39℃±2℃的温度；或该孵育处于至少或约至少30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃或37℃±2℃的温度。84.如权利要求76-83中任一项所述的方法，其中该孵育的至少一部分处于30℃±2℃，并且该孵育的至少一部分处于37℃±2℃。85.如权利要求68-84中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在(a)中的该引入和(b)中的该引入之间使这些细胞静置。86.如权利要求70-85中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是酶促活性Cas9。87.如权利要求68-86中任一项所述的方法，其中该至少一种gRNA包括靶向结构域，该靶向结构域包含选自下组的序列，该组由以下组成：GUCUGGGCGGUGCUACAACU(SEQIDNO:508)、GCCCUGGCCAGUCGUCU(SEQIDNO:514)、CGUCUGGGCGGUGCUACAAC(SEQIDNO:1533)、UGUAGCACCGCCCAGACGAC(SEQIDNO:579)、CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQIDNO:582)和CACCUACCUAAGAACCAUCC(SEQIDNO:723)。88.如权利要求68-87中任一项所述的方法，其中该至少一种gRNA包括靶向结构域，该靶向结构域包含序列CGACUGGCCAGGGCGCCUGU(SEQIDNO:582)。89.如权利要求68-79中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是切口酶，并且两种Cas9分子/gRNA分子复合物由两种不同的gRNA分子指导，以在该靶结构域的相对链上以两个单链断裂来切割该靶结构域。90.如权利要求70-89中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是金黄色葡萄球菌Cas9分子。91.如权利要求70-90中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是化脓性链球菌Cas9。92.如权利要求70-91中任一项所述的方法，其中该Cas9分子缺乏活性RuvC结构域或活性HNH结构域。93.如权利要求70-89、91和92中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是包含D10A突变的化脓性链球菌Cas9分子。94.如权利要求89-93中任一项所述的方法，其中该两种gRNA分子包含选自以下靶向结构域对的靶向结构域：95.如权利要求70-89和91-94中任一项所述的方法，其中该Cas9分子是包含N863A突变的化脓性链球菌Cas9分子。96.如权利要求94所述的方法，其中该两种gRNA分子包含选自以下靶向结构域对的靶向结构域：97.如权利要求68-96中任一项所述的方法，其中该遗传破坏包括双链断裂的产生，该双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)修复以实现该PDCD1基因中的插入和缺失(indel)。98.如权利要求68-97中任一项所述的方法，其中该重组受体是功能性非TCR抗原受体或转基因TCR。99.如权利要求68-98中任一项所述的方法，其中该重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。100.如权利要求99所述的方法，其中该CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是抗体或抗体片段。101.如权利要求100所述的方法，其中该抗体片段是单链片段。102.如权利要求100或权利要求101所述的方法，其中该抗体片段包含通过柔性免疫球蛋白接头连接的抗体可变区。103.如权利要求100-102中任一项所述的方法，其中该片段包含scFv。104.如权利要求100-103中任一项所述的方法，其中该抗原与疾病或障碍相关联。105.如权利要求104所述的方法，其中该疾病或障碍是感染性疾病或病症、自身免疫性疾病、炎性疾病或肿瘤或癌症。106.如权利要求68-105中任一项所述的方法，其中该重组受体特异性结合肿瘤抗原。107.如权利要求68-106中任一项所述的方法，其中该抗原选自ROR1、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、LewisY、L1-细胞黏附分子(CD171)、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、瘤胚抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGEA3、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、周期蛋白A1(CCNA1)、BCMA和白细胞介素12。108.如权利要求68-107中任一项所述的方法，其中该重组受体包含含有ITAM的细胞内信号传导结构域。109.如权利要求108所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内结构域。110.如权利要求108或权利要求109所述的方法，其中该重组受体进一步包含共刺激信号传导区。111.如权利要求110所述的方法，其中该共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB的信号传导结构域。112.如权利要求68-111中任一项所述的方法，其中编码该重组受体的核酸是病毒载体。113.如权利要求112所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒载体。114.如权利要求112或权利要求113所述的方法，其中该病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。115.如权利要求68-114中任一项所述的方法，其中编码该重组载体的核酸的引入是通过转导，该转导任选地是逆转录病毒转导。116.如权利要求68-115中任一项所述的方法，其中该免疫细胞是来自受试者的原代细胞。117.如权利要求68-116中任一项所述的方法，其中该免疫细胞是人细胞。118.如权利要求68-117中任一项所述的方法，其中该免疫细胞是白细胞。119.如权利要求68-118中任一项所述的方法，其中该免疫细胞是NK细胞或T细胞。120.如权利要求119所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞，该T细胞是未分级的T细胞、分离的CD8+T细胞或分离的CD4+T细胞。121.如权利要求68-120中任一项所述的方法，该方法在多种免疫细胞上进行。122.如权利要求68-121中任一项所述的方法，其中在引入该剂和引入该重组受体之后，细胞没有针对以下进行富集或选择：(a)含有该遗传破坏或不表达该内源性PD-1多肽的细胞，(b)表达该重组受体的细胞，或(a)和(b)两者。123.如权利要求68-122中任一项所述的方法，该方法进一步包括针对以下进行富集或选择：(a)含有该遗传破坏或不表达该内源性PD-1多肽的细胞，(b)表达该重组受体的细胞，或(a)和(b)两者。124.如权利要求68-123中任一项所述的方法，该方法进一步包括在或约在37℃±2℃下孵育这些细胞。125.如权利要求124所述的方法，其中该孵育进行以下时间：在1小时或约1小时与96小时或约96小时之间、在4小时或约4小时与72小时或约72小时之间、在8小时或约8小时与48小时或约48小时之间、在12小时或约12小时与36小时或约36小时之间、在6小时或约6小时与24小时或约24小时之间、在36小时或约36小时与96小时或约96小时之间，包括端值。126.如权利要求125所述的方法，其中该孵育或该孵育的一部分在刺激剂的存在下进行。127.如权利要求126所述的方法，其中该刺激剂是能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的剂。128.如权利要求126或权利要求127所述的方法，其中该刺激剂是或包含对CD3具有特异性的抗体、对CD28具有特异性的抗体和/或细胞因子。129.如权利要求68-128中任一项所述的方法，该方法进一步包括将由该方法产生的细胞在药学上可接受的缓冲剂中配制。130.如权利要求68-129中任一项所述的方法，其中该方法产生细胞群体，在该细胞群体中：至少约70％、至少约75％、或至少约80％的细胞既1)含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；又2)表达该重组受体；或至少约70％、至少约75％、或至少约80％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，或不表达PD-1多肽。131.如权利要求68-130中任一项所述的方法，其中该方法产生细胞群体，在该细胞群体中：大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的细胞既1)含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；又2)表达该重组受体；和/或大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，和/或不表达PD-1多肽。132.如权利要求68-131中任一项所述的方法，其中基因组中该基因的两个等位基因都被破坏。133.一种基因工程化免疫细胞，该基因工程化免疫细胞通过如权利要求68-132中任一项所述的方法产生。134.多种基因工程化免疫细胞，这些基因工程化免疫细胞通过如权利要求68-132中任一项所述的方法产生。135.如权利要求134所述的多种基因工程化免疫细胞，其中：至少约70％、至少约75％、或至少约80％的细胞既1)含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；又2)表达该重组受体；或至少约70％、至少约75％、或至少约80％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，或不表达PD-1多肽。136.如权利要求134或权利要求135所述的多种基因工程化免疫细胞，其中：大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的细胞既1)含有该遗传破坏；不表达该内源性PD-1多肽；不含连续的PDCD1基因、PDCD1基因、和/或功能性PDCD1基因；和/或不表达PD-1多肽；又2)表达该重组受体；和/或大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％的表达该重组受体的细胞含有该遗传破坏，不表达该内源性PD-1多肽，和/或不表达PD-1多肽。137.一种组合物，该组合物包含如权利要求133所述的基因工程化免疫细胞或如权利要求134-136中任一项所述的多种基因工程化免疫细胞以及任选地药学上可接受的缓冲剂。138.一种治疗方法，该治疗方法包括将如权利要求1-67和137中任一项所述的组合物给予患有疾病或病症的受试者。139.如权利要求138所述的方法，其中该重组受体特异性结合与该疾病或病症相关联的抗原。140.如权利要求138或权利要求139所述的方法，其中该疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。141.如权利要求140所述的方法，其中该癌症或肿瘤是白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、和/或间皮瘤。142.如权利要求139-141中任一项所述的方法，其中该抗原选自下组，该组由以下组成：孤儿酪氨酸激酶受体ROR1，tEGFR，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2、3、或4，FBP，胎儿型乙酰胆碱受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，LewisY，L1-细胞黏附分子，MAGE-A1，间皮素，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，瘤胚抗原，ROR1，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原，PSMA，Her2/neu，雌激素受体，孕酮受体，肝配蛋白B2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，MAGEA3，CE7，肾母细胞瘤1(WT-1)，周期蛋白A1(CCNA1)，BCMA和白细胞介素12。143.如权利要求139-142中任一项所述的方法，其中该抗原是CD19或BCMA。144.如权利要求138-143中任一项所述的方法，其中给予该受试者的工程化细胞在给予后减少和/或消除了PD-1的表达持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、1个月、2个月或更长时间。145.如权利要求138-144中任一项所述的方法，其中给予该受试者的工程化细胞在给予后在该受试者中持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、1个月、2个月或更长时间。146.如权利要求138-145中任一项所述的方法，其中，在给予该组合物后的时间点：表达该重组受体且不表达PD-1的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的；含有该遗传破坏的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的；含有该遗传破坏且表达该重组受体的细胞在该受试者的血液中或来自该受试者的血液来源的样品中或在该受试者的组织或生物样品中是可检测到的。147.如权利要求138-146中任一项所述的方法，其中该时间点为或约为给予后7、8、9、10、11、12、13、或14天或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周。148.如权利要求138-147所述的方法，其中在该血液或样品中可检测到的所述细胞以如下浓度或约如下浓度或至少如下浓度或至少约如下浓度存在：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或100个细胞/微升的血液，和/或代表在该血液中至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的T细胞。149.如权利要求138-148中任一项所述的方法，其中，在给予后：在该组合物中包含该遗传破坏的细胞在该受试者中以如下速率和/或持续如下时间来扩增和/或持续存在：该速率和/或时间与在该组合物中不含该遗传破坏的T细胞的扩增和/或持续性、和/或T细胞表达该重组受体但不包含该缺失的参考组合物的T细胞的扩增和/或持续性至少相同、任选地更大；和/或在该组合物中包含该遗传破坏且包含该重组受体的细胞在该受试者中以如下速率和/或持续如下时间来扩增和/或持续存在：该速率和/或时间与在该组合物中不含该遗传破坏的T细胞的扩增和/或持续性、和/或T细胞表达该重组受体但不包含该缺失的参考组合物的T细胞的扩增和/或持续性至少相同、任选地更大。150.如权利要求149所述的方法，其中该速率或时间至少或至少约大1.5倍或2倍或3倍。151.如权利要求140-150中任一项所述的方法，其中该肿瘤是实体瘤。152.如权利要求140-151中任一项所述的方法，其中该肿瘤不是B细胞衍生的肿瘤，不是白血病和/或不是淋巴瘤。153.如权利要求140-152中任一项所述的方法，其中该肿瘤或其细胞表达或已经观察到表达PD-1的配体。154.一种药物组合物，该药物组合物包含工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞包含(a)特异性结合抗原的重组受体；和(b)编码PD-1多肽的PDCD1基因的遗传破坏，所述遗传破坏预防或减少所述PD-1多肽的表达，其中该工程化细胞在给予受试者之前具有降低和/或消除的PD-1表达的表型，并且其中在给予该受试者之后，这些细胞维持该表型持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、1个月、2个月或更长时间。155.如权利要求1-67、137和154中任一项所述的组合物，用于治疗受试者的疾病或病症。156.如权利要求155所述的使用的组合物，其中该重组受体特异性结合与该疾病或病症相关联的抗原。157.如权利要求155或权利要求156所述的使用的组合物，其中该疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或障碍、或感染性疾病。158.如权利要求155-157中任一项所述的使用的组合物，其中该疾病或病症是癌症或肿瘤，该癌症或肿瘤是白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·萨瑟，G·G·韦斯特德，D·A·邦克罗特，A·E·弗里德兰，J·琼斯，M·L·马德尔，C·奈，E·M·鲁比奥，R·萨蒙，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，爱迪塔斯医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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