一种检测头孢噻呋药物残留的快速检测试纸条制造技术

本发明专利技术试纸条属于食品安全快速检测领域。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜上包被有头孢噻呋‑载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线；结合物释放垫包被有头孢噻呋的胶体金标记物。该试纸条可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液充分吸收与金标抗体完全接触而充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中的一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。

A rapid test strip for detection of ceftiofur residues

The test strip of the invention belongs to the field of fast food safety detection. The test strip consists of a bottom plate, a sample pad attached to the bottom plate in turn, a bond release pad, a reaction film and a water absorbent pad. Some areas of the bond release pad are covered under the sample absorption pad. A detection line consisting of ceftiofur carrier protein conjugates and a quality control line consisting of sheep anti-mouse IgG were coated on the reaction membrane, and a colloidal gold label consisting of ceftiofur was coated on the conjugate release pad. The test strip can prolong the observation time of the test results, and the sample absorption pad can also fully absorb the test solution and fully react with the gold-labelled antibody, and then react on the reaction membrane by chromatography, which can effectively reduce the error. It can also prevent some interfering components from inactivating the protein in the gold label antibody and affecting the binding of the gold label antibody to the coated original.

【技术实现步骤摘要】
一种检测头孢噻呋药物残留的快速检测试纸条
本专利技术涉及一种检测头孢噻呋药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。技术背景头孢噻呋（ceftiofur）又名赛得福，是第１个动物专用的第３代头孢菌素类抗生素。1988年，FDA批准了头孢噻呋钠用于治疗牛呼吸道细菌性疾病，此时该药在美国首次上市。此后FDA又陆续批准了头孢噻呋钠、盐酸头孢噻呋及头孢噻呋晶体自由酸用于１日龄鸡、火鸡，猪、肉牛、奶牛、马、山羊及绵羊等的呼吸道疾病的治疗。加拿大、日本及欧洲一些国家也相继正式批准用于猪、肉牛、奶牛、羊的呼吸道疾病的治疗。头孢噻呋抗菌谱广，抗菌活性强，对革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有很强的抗菌活性，而且对胃酸和β内酰胺酶较稳定，过敏反应少，体内残留非常低，在世界范围内得到广泛应用。目前，国内有多家公司相继研制出头孢噻呋注射液，但制剂的溶剂体系均为植物油、大豆油等油性介质。华南农业大学联合洛阳惠中兽药有限公司在国内首先研制出水性头孢噻呋注射液，由于其溶剂体系为水性，流动性好，易于吸收，肌注时不容易堵塞针头，对动物的刺激性小，具有广阔的市场应用前景。目前，在肉类组织中，对于头孢噻呋的检测方法有许多，液制连用(LC—MS)、气质连用(GC-MS)、ELISA等等。但是这些方法速度慢，容易受较多因素影响，准确率不高。目前，检测头孢噻呋残留量的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的：研制出特异、敏感、快速、简便的头孢噻呋药物残留快速检测试纸条。本专利技术的技术方案：一种头孢噻呋药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联头孢噻呋药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附头孢噻呋药物的金标抗体玻璃棉，头孢噻呋药物金标抗体为胶体金标记头孢噻呋药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联头孢噻呋药物的载体蛋白溶液为头孢噻呋药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联头孢噻呋药物的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），或为鸡卵清白蛋白（OVA），或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。本专利技术的头孢噻呋药物残留快速检测试纸条具有以下优点:(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。(2)操作简便、快速。使用本专利技术试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μl左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果。(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I”及“Ⅱ”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“l”印迹表示在被检测样品液中含有头孢噻呋，两条棕红色“Ⅱ”印迹表示在被检样品中不含头孢噻呋，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。(5)应用范围广，便于推广应用。本专利技术快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。附图说明图1为头孢噻呋药物残留快速检测试纸条结构示意图（其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板）。图2为头孢噻呋药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图（其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线）。图3为头孢噻呋药物快速检测试纸卡阴性（图3.a）、阳性（图3.b），无效（图3.c）显色示意图，其中T质控区，C为检测区。具体实施方式制备头孢噻呋药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联头孢噻呋药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维;其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。1.头孢噻呋药物与载体蛋白的偶联分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将头孢噻呋药物和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原（用于固定在反应膜上）和免疫原（用于制备单克隆抗体）。(1)包被原的制备：①将5mg头孢噻呋药物0.5mL甲酰胺（DMF）溶解，冷却至10℃,加入氯甲酸异丁酯5μ1,4℃搅拌反应30min，即可得到反应液Ⅰ液;②称取卵清蛋白（OVA）30mg，使之充分溶解在2mL50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液Ⅱ液;其中头孢噻呋药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为（15-20）:1。③将反应Ⅰ液逐滴缓慢滴加到该反应Ⅱ溶液中，4℃反应4h，4℃过夜。取最终反应物于pH7.4，0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化24h，3000g以上离心30min，收集上清液，即得到包被原。(2)免疫原的制备：①将5mg头孢噻呋药物、10mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），以及12.5mg碳化二亚胺（EDC）充分溶解于1mLDMF中，于室温下搅拌24h，即可得到反应液Ⅰ液;②称取血蓝蛋白40mg，使之充分溶解在3mL40mM碳酸钠溶液中，即得到反应液Ⅱ液，其中头孢噻呋药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为（12-15）:1。③将反应液Ⅰ液逐滴缓慢滴加到反应液Ⅱ液中，并于室温下搅拌3h，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。2.抗头孢噻呋药物单克隆抗体的制备(1)动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7：1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏：将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1X106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射头孢噻呋药物的单克隆杂交瘤细胞株5X107个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，于-20℃保存。3.头孢噻呋药物金标抗体和金标抗体玻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种头孢噻呋药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联头孢噻呋药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。

【技术特征摘要】
1.一种头孢噻呋药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联头孢噻呋药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：吸水材料层用吸水纸制成。5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，杜霞，张淑雅，
申请(专利权)人：镇江亿特生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32