高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用技术

本申请公开了一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。本申请方法，包括采用定制微孔芯片和ICELL8平台识别单细胞，并在微孔芯片微孔中，对单细胞进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，产物可直接用于测序；在mRNA逆转录或Tn5转座酶建库过程中，引入5’端和3’端双端Barcode序列，以获得单细胞全长转录组。本申请方法，单细胞识别通量高，且产物可直接测序。采用本申请方法进行单细胞测序，只需两天时间，即可一次性高效获取数千个单细胞层面全长转录组库，大大降低了人工和时间成本，并且微量反应体系也大大降低了试剂成本，为大规模单细胞全长转录本测序奠定了基础。

Construction and application of high-throughput single-cell full-length transcriptome sequencing Library

This application discloses a method for constructing a high throughput single cell full-length transcriptome sequencing library and its application. The application method includes the identification of single cells by using customized microporous chips and ICELL8 platform, and the construction of cell lysis, RNA reverse transcription, pre-amplification of cDNA and TN5 transposase libraries in microporous chips. The products can be directly used for sequencing. During the construction of RNA reverse transcription or TN5 transposase libraries, the 5'and 3' double-ended Barcode sequences are introduced to obtain the full-length translocation of single cells. Record group. In this application method, the single cell recognition flux is high and the products can be directly sequenced. Using this method for single-cell sequencing, thousands of single-cell-level full-length transcriptome libraries can be obtained efficiently in only two days, which greatly reduces the cost of human and time, and the cost of reagents can be greatly reduced by the micro-reaction system, thus laying the foundation for large-scale single-cell full-length transcription basic sequencing.

【技术实现步骤摘要】
高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用
本申请涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种高通量的单细胞全长转录组库的制备方法及其应用。
技术介绍
近年来单细胞测序技术飞速发展，在发育研究及癌症研究等领域取得了重要成果，但高昂的实验费用是矗立在研究人员面前一道难以逾越的障碍，因此高通量、低成本的单细胞制备技术和测序平台仍然有广阔的前景。目前商品化的单细胞处理平台包括FluidigmC1，10×genomics的GemCode，以及Wafergen的ICELL8。其中FluidigmC1通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞，该技术是在一个集成的芯片区域，有48×2共96个微小的微流控小室。每一个微流控小室均是独立分割开在不同位置，通过控制微流控小室的开关，来添加细胞液和后续的反应体系并完成反应。FluidigmC1具有时间快速、重复性好、数据稳定性好等优点，并且，可以捕获制备全长转录本。但是，FluidigmC1通量受限于其微流体芯片的设计，一次只能产生96个转录本，而且只能产生cDNA扩增产物，cDNA扩增完后需要手工将每个微流控小室的产物转移到对应的96孔板中进行后续的建库，不能直接形成文库进行测序，后续文库构建通量低、耗时长。10×genomics公司的GemCode能够与现有的短读取测序仪互补，产生10-100kb的长片段信息，实现结构变异和单体型等分析。GemCode仪器基于液滴微流控的技术，其技术核心是对单细胞进行精确分区，形成包含分子条形码的皮升(缩写pL)大小的液滴，进行后续的转录本的构建。但是该技术只能检测含有条形码一端的信息，不能检测全长转录本，而且存在0.8％～5％的多细胞比例。GemCode基于液滴微流控的方法，有液滴双包裹单细胞之间交叉污染、包裹效率低、成本高，只能产生3’端转录本信息等缺点。Wafergen公司的ICELL8也是通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞。ICELL8平台能够一次分选并识别1000个以上单细胞孔位，进行后续的转录本分析。该技术预先在微孔芯片中添加3’端Barcode序列，然后单细胞在mRNA的分离和第一链cDNA的扩增过程中结合上这段Barcode序列；cDNA收集之后，只有含有这段Barcode的3’端序列才能被区分开来。ICELL8采用的是纳升(缩写nL)级微孔芯片技术，但受限于微孔芯片的容量问题，只能产生3’端转录本信息；后续文库构建通量低、耗时长。因此目前尚没有理想的技术可以在单细胞层面实现高通量的全长转录本的扩增的同时，实现一体化的测序文库构建，以缩短测序时间和费用。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种改进的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，包括对细胞进行染色后，采用定制的微孔芯片和ICELL8平台系统识别单细胞，并且在微孔芯片的微孔中，对识别获得的单细胞依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库；其中，在mRNA逆转录过程中，添加5’端和3’端的双端Barcode序列，生成5’端和3’端分别具有Barcode序列的cDNA；或者在Tn5转座酶建库的核酸片段化过程，对核酸片段的5’端和3’端分别添加Barcode序列；又或者在Tn5转座酶建库的片段化DNA扩增过程时，分别在扩增的上下游引物中设计5’端Barcode序列和3’端Barcode序列；通过5’端和3’端的双端Barcode序列，获得单细胞的全长转录组。其中，定制的微孔芯片是与ICELL8平台系统匹配的定制微孔芯片，与现有的Wafergen微孔芯片相比，定制微孔芯片的微孔容积为350nL，芯片高度2.2mm，微孔容积的增加使得后续在微孔中进行一体化建库得以实现。Barcode序列可以采用测序平台常规使用的Barcode序列，本申请的一种实现方式中，采用的是BGISEQ-500的10bpBarcode序列。需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，一方面，借助ICELL8平台能够准确的进行高通量的单细胞识别。另一方面，借助定制的微孔芯片可以实现在微孔中依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，从而实现一体化操作，所得产物可以直接用于测序，自动化程度高，避免了如FluidigmC1微流体芯片处理后还要进行后续人工建库的问题，提高了建库和测序效率，大大降低了人工操作时间和单细胞测序时间。再一方面，通过5’端和3’端双端Barcode序列的设计，可以制备全长转录本；保障了单细胞全长转录组测序的准确性和完整性。优选的，Tn5转座酶建库依序包括以下步骤，(1)对cDNA预扩增的产物进行片段化；(2)对片段化的产物进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行片段选择；(4)对步骤(3)选择的片段进行单链DNA环化连接；(5)对单链DNA环化连接产物进行外切酶消化和磁珠纯化，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，采用DNA纳米球(缩写DNB)测序技术，因此，需要对PCR扩增后选择的片段进行单链DNA环化连接。可以理解，如果不是采用DNA纳米球测序，则不需要进行单链DNA环化连接，直接步骤(3)选择的片段或者片段选择后磁珠纯化即可作为后续测序的单细胞转录组测序文库。优选的，细胞进行染色具体包括，采用Hoechst和PI染料MIX对细胞进行染色。本申请的另一面公开了本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法在单细胞测序中的应用。本申请的再一面公开了一种高通量的单细胞测序方法，包括采用本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，进行单细胞测序文库构建，然后采用高通量测序平台进行测序。其中，高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法中，高通量是指能够一次性处理大量的单细胞；高通量测序是指能够一次性对大量的核酸进行测序。优选的，高通量测序平台为BGISEQ-500平台。优选的，高通量测序采用一条链测三段的测序模式。需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，能够高通量的获得大量单细胞的全长转录组测序文库，特别适合用于大量单细胞检测的实际应用；并且结合高通量测序平台，可以准确的对大量的单细胞进行测序；提高了单细胞测序的质量和效率。本申请的再一面公开了本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或本申请的单细胞测序方法在制备发育研究或癌症研究的检测试剂盒、检测装置或检测系统中的应用。需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或单细胞测序方法，在本申请的一种实现方式中，只需两天时间，即可一次性高效地获取数千个单细胞层面的全长转录组库，直接高通量测序，大大降低了人工操作时间和测序时间；同时，微量的反应体系也大大降低了实验试剂成本，使得大规模单细胞全长转录本测序成为可能；特别适用于发育研究或癌症研究，因此，基于本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或单细胞测序方法，可以开发相应的发育研究或癌症研究的检测试剂盒、检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：包括对细胞进行染色后，采用定制的微孔芯片和ICELL8平台系统识别单细胞，并且在微孔芯片的微孔中，对识别获得的单细胞依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库；其中，在mRNA逆转录过程中，添加5’端和3’端的双端Barcode序列，生成5’端和3’端分别具有Barcode序列的cDNA；或者在Tn5转座酶建库的cDNA片段化过程，对核酸片段的5’端和3’端分别添加Barcode序列；又或者在Tn5转座酶建库的片段化后DNA扩增过程时，分别在扩增的上下游引物中设计5’端Barcode序列和3’端Barcode序列；通过5’端和3’端的双端Barcode序列，获得单细胞的全长转录组。

【技术特征摘要】
1.一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：包括对细胞进行染色后，采用定制的微孔芯片和ICELL8平台系统识别单细胞，并且在微孔芯片的微孔中，对识别获得的单细胞依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库；其中，在mRNA逆转录过程中，添加5’端和3’端的双端Barcode序列，生成5’端和3’端分别具有Barcode序列的cDNA；或者在Tn5转座酶建库的cDNA片段化过程，对核酸片段的5’端和3’端分别添加Barcode序列；又或者在Tn5转座酶建库的片段化后DNA扩增过程时，分别在扩增的上下游引物中设计5’端Barcode序列和3’端Barcode序列；通过5’端和3’端的双端Barcode序列，获得单细胞的全长转录组。2.根据权利要求1所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：所述Tn5转座酶建库依序包括以下步骤，(1)对cDNA预扩增的产物进行片段化；(2)对片段化的产物进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行片段选择；(4)对步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹丹，吴靓，厉磊，赵至坤，刘石平，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44