一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa制造技术

一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，属于基因工程技术领域，其特征在于一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列，设计引物，加上Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点，扩增CREB1基因CDS区；然后进行中性突变，酶切载体，连接目的片段与载体，重组表达载体，亚克隆完成后进行点突变，分别检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平，结果显示过表达FYJNa可上调ABCC1的mRNA和蛋白水平的表达。

An Overexpression Vector FYJNa that Can Increase ABCC1 Gene Expression in Cells

An overexpression vector FYJNa, which can significantly enhance the expression of ABCC1 gene in cells, belongs to the field of genetic engineering technology. It is characterized by the nucleotide sequence of an overexpression vector FYJNa, which can significantly enhance the expression of ABCC1 gene in cells, as shown in Seq ID No:1. After total RNA was extracted from A549/DDP cells, the CDS region of CREB1 gene and its corresponding RNA sequence were retranscribed to the DNA. Primers were designed to amplify the CDS region of CREB1 gene with Hind III and EcoR I digestion sites. Then neutral mutation, digestion vectors, ligation of target fragments and vectors, recombination expression vectors and point mutation were performed after subcloning, respectively, FYJNa and ABC were detected. The results showed that overexpression of FYJNa could up-regulate the expression of ABCC1.

【技术实现步骤摘要】
一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa
本专利技术涉及一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，属于基因工程

技术介绍
ABCC1基因是ATP结合盒(ABC)药物转运蛋白超家族中C亚族成员之一，于1992年首次从耐药肺癌细胞系H69AR中鉴定出来(Coleetal.,1992)；该基因定位于染色体16p13.11，它的长度约为200,000碱基对，该基因含有34个外显子，编码1531个氨基酸的蛋白质，分子量为190kDa(évaBakosetal.,2007)。该蛋白质具有3个疏水跨膜结构域(TMD)，也称为跨膜结构域(MSD)，称为TMD0(N-末端)，TMD1(中间)和TMD2(C-末端)(omkaMetal.,2015)。ABCC1利用ATP结合/水解的能量作为主要的活性转运蛋白(Sharometal.,2015)，ABCC1具有广泛的底物特异性，其过表达细胞能够运输大量底物，如抗叶酸药物，叶酸抗代谢物，蒽环霉素，长春花生物碱等(omkaMetal.,2015)；无机阴离子，如亚砷酸盐和砷酸盐，ABCC1也是范围广泛的内源性化合物，包括谷胱甘肽(GSH)，葡糖醛酸和有机阴离子，如炎症介质白三烯C4硫酸盐共轭物的活性转运C4或雌二醇-17-β-d葡糖苷酸(E217βG)。因此，ABCC1起着的有机阴离子，阴离子药物，异生素的缀合物泵出作用，由此ABCC1已被确定多特异性有机阴离子转运蛋白(MOATs)或谷胱甘肽结合物(GS-X)泵之一(évaBakosetal.,2007，omkaMetal.,2015，Luetal.,2015，ConseilGetal.,2005))；所以ABCC1基因产物是机体排出药物保护正常细胞的关键基因之一。cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)，是核转录因子。该基因的交替剪接导致编码不同种型的几种转录物变体；作为转录激活因子，CREB1与启动子上的保守cAMP反应元件(CRE)结合，并介导对多种刺激的转录反应，包括激素，膜去极化，生长和神经营养因子，从而充当不同信号通路之间的介质(Xieetal.,2015)。近期研究发现，CREB蛋白水平在部分癌组织和细胞中呈高表达(Tanetal.,2012)，参与到肿瘤细胞的增殖、存活及转移等各个方面的调节。因此如何改造CREB1基因，构建一个可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体成为急需解决的一大难题，所以一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，在NCBI网站上找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列；根据引物设计原则用Primer5.0软件设计引物，分别在上下游加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点；以人cDNA为模板进行PCR扩增CREB1基因CDS区；然后对CREB1基因CDS区的905、908、911和914位点进行突变；酶切pcDNA3.1(+)载体；连接目的片段与pcDNA3.1(+)；重组表达载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcDNA3.1-FYJNa；突变信息如下：905的T突变为C；908的T突变为C；911的C突变为A；914的T突变为C即可得到；然后，分别通过qRT-PCR和Westernblot法检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平，专利技术一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa是必要的。
技术实现思路
为了克服如何构建一个可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa的难题，本专利技术提供了一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，该种一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，在NCBI网站上找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列；根据引物设计原则用Primer5.0软件设计引物，分别在上下游加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点；以人cDNA为模板进行PCR扩增CREB1基因CDS区；然后对CREB1基因CDS区的905,908,911和914位点进行突变；酶切pcDNA3.1(+)载体；连接目的片段与pcDNA3.1(+)；重组表达载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcDNA3.1-FYJNa；突变信息如下：905的T突变为C；908的T突变为C；911的C突变为A；914的T突变为C即可得到；然后，分别通过qRT-PCR和Westernblot法检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平；结果显示过表达FYJNa可上调ABCC1的mRNA和蛋白水平的表达。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，具体方案如下：1.A549/DDP细胞复苏和培养1.1细胞复苏：(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内快速摇晃；(2)待其全部融化，缓慢注入含5mL1640培养基的离心管中，1000g离心5min弃上清；(3)5mL1640培养基悬浮沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。1.2A549/DDP细胞传代培养：(1)弃原瓶内培养基，用5mLPBS轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；(4)再加入10mL培养基混合均匀后，分别取出5mL培养基加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。1.3A549/DDP细胞正常形态图：肺癌A549/DDP细胞复苏及传代培养之后，其生长状态如图2所示，可见细胞贴壁生长，折光率良好，生长状态良好。2.通过点突变检测FYJNa对MRP1基因表达的调控2.1CREB1过表达载体的构建：(1)在NCBI网站上找到CREB1基因(GeneID：692871)的CDS区及对应的mRNA(NM_134442.4)序列；(2)根据引物设计原则用Primer5.0软件设计引物，分别在上下游加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，引物序列：CREB1-F：5’-CCCAAGCTTATGACCATGGAATCTGGAGC-3’；CREB1-R：5’-CCGGAATTCTTAATCTGATTTGTGGCAG-3’；(3)以人cDNA为模板进行PCR扩增CREB1基因CDS区；(4)酶切pcDNA3.1(+)载体；(5)连接目的片段与pcDNA3.1(+)；(6)重组表达载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcDNA3.1-CREB1。2.2FYJNa过表达突变载体的构建：(1)在NCBI网站上找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列(编号：NM_134442.4；HomosapienscAMPresponsiveelementbindingprotein1(CREB1),VERSIONNM_134442.4)；(2)根据引物设计原则用Primer5.0软件设计引物，分别在上下游加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点；(3)以人cDNA为模板进行PCR扩增CREB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，其特征在于一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa，其特征在于一种可显著...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵淑丽，张伟伟，张珍珠，冯云佳楠，刘祥露，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23