利用免疫球蛋白片段的位点特异性GLP-2缀合物制造技术

本发明专利技术涉及利用免疫球蛋白片段的位点特异性GLP‑2缀合物。本发明专利技术涉及胰高血糖素‑样肽‑2(GLP‑2)缀合物，其包括经非肽基聚合物共价连接的天然GLP‑2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中天然GLP‑2或其衍生物具有在其C‑末端引入的巯基基团，并且非肽基聚合物的一端连接至GLP‑2的氨基酸残基而不是其N‑末端氨基基团；用于制备GLP‑2缀合物的方法；包括其的药学组合物；和通过使用其用于治疗或预防肠道疾病、肠道损伤或胃病的方法。因为本发明专利技术的GLP‑2缀合物具有针对GLP‑2受体显著增加的结合亲和力，所以其显示延长的体内半衰期和改进的体内持久性和稳定性。

Site-specific GLP-2 conjugate using immunoglobulin fragments

The present invention relates to site-specific GLP 2 conjugate using immunoglobulin fragments. The present invention relates to glucagon-like peptide 2 (GLP 2) conjugates, which include natural GLP 2 or its derivatives covalently linked by non-peptide-based polymers and immunoglobulin Fc fragments, in which natural GLP 2 or its derivatives have thiol groups introduced at its C end, and one end of non-peptide-based polymers is linked to the amino acid residues of GLP 2 rather than its N end amino groups. Methods for preparing GLP 2 conjugates; pharmaceutical compositions thereof; and methods for treating or preventing intestinal diseases, intestinal injury or gastric diseases by using GLP 2 conjugates. Because the GLP 2 conjugate of the present invention has significantly increased binding affinity for GLP 2 receptor, it shows prolonged in vivo half-life and improved in vivo persistence and stability.

【技术实现步骤摘要】
利用免疫球蛋白片段的位点特异性GLP-2缀合物本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年12月28日，申请号为201280071002.9，专利技术名称为“利用免疫球蛋白片段的位点特异性GLP-2缀合物”。
本专利技术涉及胰高血糖素-样肽-2(GLP-2)缀合物，其中在其C-末端具有引入的巯基基团的GLP-2或其衍生物通过非肽基聚合物共价连接至免疫球蛋白Fc片段，其中非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc片段位点-特异性地连接至GLP-2或其衍生物的氨基酸残基而不是其N-末端氨基基团；用于制备GLP-2缀合物的方法；包括其的药学组合物；和通过使用其治疗或预防肠道疾病、肠道损伤或胃病的方法。
技术介绍
胰高血糖素-样肽-2(GLP-2)是33个氨基酸的肽激素，其在养分摄取时由肠道内分泌L细胞产生。GPL-2刺激小肠和大肠中的粘膜生长(DGBurrin等，AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol279(6):G1249-1256，2000)并且抑制肠道细胞和隐窝细胞的细胞凋亡(BernardoYusta等，Gastrpenterology137(3)：986-996，2009)。此外，GLP-2增强小肠中养分的吸收(PALLEBJ等，Gastrpenterology120：806-815，2001)并且降低肠道通透性(CameronHL等，AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol284(6)：G905-12，2003)。另外，GLP-2抑制胃排空和胃酸分泌(MeierJJ等，Gastrpenterology130(1)：44-54，2006)，同时增加肠道血液流速(BremholmL等，ScandJGastroenterol.44(3)：314-9，2009)和松弛肠道平滑肌(AmatoA等，AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.296(3)：G678-84，2009)。因为GLP-2能够吸收和保持能量并且激活肠道细胞的功能，已经在肠道疾病和损伤的各种体内模型中显示高的治疗潜能。作为调节养分吸收的激素，GLP-2具有很大的希望用于治疗短肠综合症(SBS)的疗法。SBS由先天的原因或后天的原因，比如外科手术去除肠造成，并且导致由于小肠吸收面积下降而引起的营养不足。已经报道GLP-2改善具有SBS的大鼠模型的消化道中养分摄取和吸收(LjungmannK等，AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.281(3)：G779-85，2001)。此外，克罗恩病是慢性炎症肠道疾病，其可在消化道从口至肛门范围的任何区域产生。至今不知道克罗恩病的原因，但是认为是由于身体对消化道中正常存在的细菌细胞过度的炎症反应以及环境和遗传原因引起的。已知GLP-2可防止或减轻当由于化疗或遗传原因发展粘膜炎、结肠炎或炎症肠道疾病时粘膜上皮细胞的伤害(QiangXiao等，AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol.278(4)：R1057-R1063，2000)。化学疗法诱导的腹泻(CID)是限制抗癌剂剂量的因素之一并且是抗癌化学疗法的最常见副作用。大约10％的患者具有晚期癌症。大约80％的具有晚期癌症接受5-FU(5-氟尿嘧啶，Adrucil)/伊立替康(Camptosar)单个/组合疗法的患者经历CID并且他们的大约30％显示3至5级的严重腹泻症状。另外，如果粘膜炎或嗜中性细胞减少症在具有的CID患者中同时发生，有死亡的危险。在CID诱导的大鼠模型中，GLP-2显示减轻由5-FU诱导的肠重量、绒毛高度和隐窝深度减小的影响，从而表明其用于CID治疗的治疗潜能(A.Tavakkolizadeh等，JSurgRes.91(1)：77-82，2000)。尽管该高的治疗潜能，GLP-2仍具有开发成为商用药物的局限性。肽比如GLP-2可由于低稳定性而容易转化，容易被体内蛋白酶降解并且丧失活性，并且由于它们相对小的尺寸而容易通过肾清除。所以，为了维持肽药物的最佳血液浓度和滴度，需要更频繁施用肽药物。但是，大部分肽药物以各种类型的注射施用，并且需要频繁的注射以维持肽药物的血液浓度，其造成患者的严重疼痛。在这点上，已经进行许多尝试以解决这些问题，其中之一已经开发了增加肽药物的膜通透性的方法，其使得肽药物通过口服或鼻途径递送至身体。但是该方法与其注射相比具有低肽药物递送效率的局限性，并且因此仍难以保持足够的用于治疗用途的肽药物的生物活性。尤其，GLP-2具有非常短的体内半衰期(7分钟或更短)，原因在于其被二肽基肽酶-IV(DPPIV)失活，所述二肽基肽酶-IV在GLP-2的2位(Ala)和3位(Asp)氨基酸之间切割(BoletteH.等，TheJournalofClinicalEndocrinology&Metabolism.85(8)：2884-2888，2000)。已经尝试通过氨基酸替代增加GLP-2的体内半衰期。目前，NPS药物公司(美国)正在开发GLP-2类似物“Teduglutide”，作为用于克罗恩病、SBS和胃肠道疾病的治疗剂，其中在天然GLP-2的2位氨基酸(Ala)被天冬酰胺(Asp)替代。通过在2位氨基酸的替代Teduglutide抵抗DPPIV的切割，其反过来增加稳定性和效力。但是，因为对DPPIV切割的抵抗力的增加不足以延长Teduglutide的体内半衰期。因此，Teduglutide也需要通过注射每天施用一次，其对患者仍是大的负担(WO2005/067368)。ZealandPharma(丹麦)目前正通过替代在天然GLP-2的3、8、16、24、28、31、32和33位的一个或多个氨基酸来开发GLP-2类似物。这些替代不仅仅增强肽的稳定性和效力，而且也允许通过根据替代的位置使得小肠中相对于结肠中的生长促进活性更高而选择性治疗症状或反之亦然。另外，ZealandPharma正在开发作为GLP-2类似物的Elsiglutide(ZP1846)，其靶向胃肠道(GI)-粘膜炎和CID，并且Elsiglutide正在进行I期临床试验。但是，上述类似物也不具有足够的体内半衰期，并且因此其需要通过每天注射一次施用(WO2006/117565)。聚乙二醇(PEG)非特异性结合靶肽的特异性位点或不同位点并且增加其分子量，从而预防靶肽的肾清除和水解，而不产生任何副作用。例如，美国专利号4,179,337描述了用PEG连接降钙素，以增强降钙素的体内半衰期和膜通透性的方法。WO2006/076471描述了通过连接PEG用于增加已经用作充血性心力衰竭的治疗剂的B-型利钠肽(BNP)体内半衰期的方法。另外，美国专利号6,924,264公开了通过用其赖氨酸残基连接PEG增加艾塞那肽-4(exendin-4)体内半衰期的方法。尽管这些方法可通过增加待与其连接的PEG的分子量延长肽药物的体内半衰期，但是有许多问题，在于随着PEG的分子量增加，肽药物的滴度下降并且PEG与肽药物的反应性也降低，导致产率下降。WO02/46227描述了制备GLP-1、艾塞那肽-4(exendin-4)或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.胰高血糖素‑样肽‑2(GLP‑2)缀合物，其包括经非肽基聚合物共价连接的GLP‑2衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中所述GLP‑2衍生物具有在其C‑末端引入的巯基基团，和所述非肽基聚合物的一端连接至所述GLP‑2的氨基酸残基而不是其N‑末端氨基基团，其中所述GLP‑2衍生物的所述巯基基团通过使半胱氨酸结合至天然GLP‑2或其衍生物的C‑末端而引入，并且其中所述非肽基聚合物共价连接至所述GLP‑2衍生物的所述巯基基团。

【技术特征摘要】
2011.12.30 KR 10-2011-01476841.胰高血糖素-样肽-2(GLP-2)缀合物，其包括经非肽基聚合物共价连接的GLP-2衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中所述GLP-2衍生物具有在其C-末端引入的巯基基团，和所述非肽基聚合物的一端连接至所述GLP-2的氨基酸残基而不是其N-末端氨基基团，其中所述GLP-2衍生物的所述巯基基团通过使半胱氨酸结合至天然GLP-2或其衍生物的C-末端而引入，并且其中所述非肽基聚合物共价连接至所述GLP-2衍生物的所述巯基基团。2.根据权利要求1所述的GLP-2缀合物，其中所述GLP-2衍生物通过天然GLP-2的N-末端氨基的替代、缺失或修饰而制备并且具有结合GLP-2受体的功能。3.根据权利要求2所述的GLP-2缀合物，其中所述GLP-2衍生物选自：通过去除作为所述天然GLP-2的所述N-末端的第一个氨基酸的组氨酸的α-碳和与其结合的N-末端氨基而制备的GLP-2衍生物；通过缺失所述天然GLP-2的N-末端氨基而制备的GLP-2衍生物；通过用羟基基团替代所述天然GLP-2的N-末端氨基而制备的GLP-2衍生物；通过用二甲基基团修饰所述天然GLP-2的N-末端氨基而制备的GLP-2衍生物；和通过用羧基基团替代所述天然GLP-2的N-末端氨基而制备的GLP-2衍生物。4.根据权利要求1所述的GLP-2缀合物，其中所述非肽基聚合物的一端共价连接至所述免疫球蛋白Fc片段而其另一末端共价连接至所述GLP-2衍生物的所述巯基基团。5.根据权利要求1所述的GLP-2缀合物，其中所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸和其组合。6.根据权利要求1所述的GLP-2缀合物，其中所述非肽基聚合物在其两个末端具有活性基团，其选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。7.根据权利要求6所述的GLP-2缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物选自琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟琥珀酰亚胺基和琥珀酰亚胺基碳酸酯。8.根据权利要求6所述的GLP-2缀合物，其中所述非肽基聚合物在一个末端具有马来酰亚胺基团和在另一末端具有醛基。9.根据权利要求1所述的GLP-2缀合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：金承洙，林世荣，郑圣烨，权世昌，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR