本发明专利技术提供了用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法。具体地，本发明专利技术涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包括IL‑15、IL‑21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。实验结果表明表达本发明专利技术融合蛋白的细胞能够很好地诱导NK细胞增殖、分化和活化，制备得到的NK细胞数量多、纯度高、杀伤活性强。本发明专利技术将基因串联表达，实现了其1：1的100％表达，同时简化了操作流程且大大降低了时间及人力成本。本发明专利技术优化了用于NK细胞人工抗原递呈细胞的构建方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。
Artificial antigen-presenting cells for efficient amplification of NK and their construction methods
The invention provides an artificial antigen presenting cell for efficiently amplifying NK and a construction method thereof. Specifically, the present invention relates to a fusion protein comprising IL 15, IL 21 and MICA proteins, as well as optional tag sequences and/or signal peptide sequences. The experimental results show that the cells expressing the fusion protein of the invention can well induce the proliferation, differentiation and activation of NK cells, and the prepared NK cells have large quantity, high purity and strong killing activity. The invention realizes 100% expression of 1:1 gene in series, simplifies the operation process and greatly reduces the time and human cost. The invention optimizes the construction method of NK artificial antigen presenting cells, and lays a foundation for the future application of NK cells in cancer treatment and prevention.
【技术实现步骤摘要】
用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法
本专利技术属于生物
具体地，本专利技术涉及用于高效扩增NK的人工抗原递呈细胞及其构建方法。
技术介绍
自然杀伤(NatureKiller，NK)细胞，是一种自然杀伤细胞，具有以下特征：1、无需特异性抗原识别；2、直接杀伤靶细胞；3、不受MHC限制；4、具有较广的抗瘤谱；5、基本无不良反应。在控制癌症的发生和发展中起着非常重要的作用。其可以通过释放穿孔素/颗粒酶、ADCC效应、Fas/FasL系统及NK细胞毒因子消灭人体内的病毒、细菌以及癌细胞。是人体先天免疫的核心组成部分，它是除T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第三类淋巴细胞。它作为人体第一道防线，能够清除病毒、细菌等有害物质，同时还可以清除衰老、病变及癌变的细胞，从而维持人体的健康。由于以上NK其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。在日本，NK细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还应用于亚健康人群，预防癌症发生。因此，如何获得大量的NK细胞成为目前亟待解决的问题。目前，NK细胞体外扩增培养的方法主要有以下三种：(1)使用IL-2和IL-15等白介素类细胞因子刺激培养的方法，往往需要进行分选，培养成本高，往往出现数量或纯度难以满足实验要求的情况，无法应用于大规模临床研究；(2)利用CD16等抗体进行NK活化后进行扩增培养，在不同批次细胞扩增效率和NK细胞活性上存在较大差异。因此，目前主要还是应用人工抗原递呈细胞。人工抗原递呈细胞(aAPC)是新兴起的一种免疫治疗新策略，是在一定的载体表面表达MHC及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体等，模拟天然抗原递呈细胞。而目前，现有的人工抗原递呈细胞并不能很好地扩增或活化NK细胞。因此本领域急需开发一种用于培养NK细胞的人工抗原递呈细胞及其制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于培养NK细胞的人工抗原递呈细胞及其制备方法。本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。在另一优选例中，所述融合蛋白依次包括IL-15、IL-21和MICA蛋白。在另一优选例中，所述融合蛋白中，IL-15、IL-21和MICA蛋白串联连接。在另一优选例中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白之间可以为无或通过连接肽连接。在另一优选例中，所述连接肽选自下组：柔性肽、刚性肽、2A肽、IRES、或其组合。较佳地，所述连接肽为柔性肽。在另一优选例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。在另一优选例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为1：1：1。在另一优选例中，所述融合蛋白具有式I所述结构：L-I1-X1-I2-X2-I3-X3(I)，其中，L为无、或标签序列或信号肽序列；I1为无或第一连接肽；X1为IL-15；I2为无或第二连接肽；X2为IL-21；I3为无或第三连接肽；X3为MICA蛋白；和“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。在另一优选例中，所述融合蛋白中，X1、X2和X3的位置可互换。在另一优选例中，所述L为信号肽，较佳地为来自MICA蛋白的信号肽。在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第1-23位所示。在另一优选例中，所述IL-15为人IL-15、鼠IL-15、或兔IL-15。在另一优选例中，所述IL-21为人IL-21、鼠IL-21、或兔IL-21。在另一优选例中，所述IL-15的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第33-146位所示。在另一优选例中，所述IL-21的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第156-288位所示。在另一优选例中，所述MICA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第298-663位所示。在另一优选例中，所述I1为无。在另一优选例中，所述I2为无。在另一优选例中，所述I3为无。在另一优选例中，所述I1、I2和I3各自独立地选自下组：柔性肽、刚性肽、2A肽、IRES、或其组合。在另一优选例中，所述I1、I2和I3均为不具有自剪接功能的连接肽。在另一优选例中，所述I1、I2和I3各自独立地为柔性肽。在另一优选例中，所述柔性肽为非免疫原性的，并且在各元件之间产生足够的空间距离，使相互之间的位阻效应降至最低。在另一优选例中，所述柔性肽接头含有两个或多个选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)和苏氨酸(T)的氨基酸。在另一优选例中，所述柔性肽包括一个(GmX)n序列，其中X是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、或缬氨酸(V)；m和n是整数；m是1、2、3或4；并且n是1、2、3、4、5、6或7。较佳地，X为丝氨酸(S)。在另一优选例中，所述柔性肽为GS连接肽。在另一优选例中，所述柔性肽由一个或多个(例如，1-20个，1-18个，或1-16个)甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)组成的氨基酸序列。在另一优选例中，所述柔性肽具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。在另一优选例中，所述柔性肽选自下组的序列：GSGGSGGSG(SEQIDNO.:3)或GGGGS(SEQIDNO.:4)。在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：(A)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽；(C)将SEQIDNO:2中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下特性：a)诱导免疫细胞(如NK细胞)增殖、分化和活化；和/或b)提高免疫细胞(如NK细胞)的杀伤活性。本专利技术第二方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQIDNO.:2所示融合蛋白的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述的多核苷酸编码的产物中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，较佳地为1：1：1。在另一优选例中，所述的多核苷酸中，所述IL-15、IL-21和MICA的编码序列通过连接序列串联连接。在另一优选例中，所述连接序列编码的连接肽不具有自剪接功能，较佳地为柔性肽。本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒用于表达本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述表达盒从从5’端-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括IL‑15、IL‑21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所述结构：L-I1-X1-I2-X2-I3-X3(I)，其中，L为无、或标签序列或信号肽序列；I1为无或第一连接肽；X1为IL-15；I2为无或第二连接肽；X2为IL-21；I3为无或第三连接肽；X3为MICA蛋白；“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自下组：(A)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽；(C)将SEQIDNO:2中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晨蔚，周春燕，
申请(专利权)人：上海尚泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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