使用固体对象的核酸提取方法技术

本发明专利技术涉及使用固体对象的核酸提取方法。相比传统核酸提取方法，通过在对象中形成核酸样品和亚氨酸酯化合物(imidoester compound)之间的复合物能够以更简单且成本更低的方式分离大量的和高纯度的核酸。特别是，与传统硅基材相比，用于提取核酸的薄膜设备具有改善的亲水性能，因此可更有效地提取核酸。

Nucleic acid extraction using solid objects

The present invention relates to a nucleic acid extraction method using solid objects. Compared with the traditional method of nucleic acid extraction, by forming a complex between nucleic acid sample and imidoester compound in the target, a large number of high purity nucleic acids can be separated in a simpler and cheaper way. In particular, compared with traditional silicon substrates, the membrane equipment used for nucleic acid extraction has improved hydrophilicity, so it can extract nucleic acid more effectively.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用固体对象的核酸提取方法
本专利技术涉及使用固体对象提取核酸的方法，更具体而言，涉及通过简单方法从核酸来源(包括各种真核细胞、细菌细胞、病毒细胞或体液)中提取核酸的方法。
技术介绍
核酸是鉴别疾病状态的重要分析工具，并且DNA生物标志物(如单核苷酸多态性(SNP))、突变或DNA甲基化帮助研究人员发现癌症的原因，在疾病早期阶段诊断和观察疾病状况，以及为监测和预后的巨大机会提供了重要线索。因为与其它组分(如蛋白质)相比，核酸(如DNA)的生理浓度非常低(例如，每微升全血数十纳克的DNA对比数十微克的蛋白质)，从临床样本中有效提取DNA并预浓缩对于后续程序(例如扩增和检测)非常重要。在甲基化DNA的情况下，这个问题更重要。DNA甲基化在正常真核细胞中的基因表达调控和染色质组织中起着至关重要的作用。DNA甲基化通过在胞嘧啶环的5-碳上共价添加甲基并产生5-甲基胞嘧啶而发生。这些甲基突出到DNA的主沟中并有效抑制转录。在哺乳动物DNA中，在约4％的基因组DNA中发现5-甲基胞嘧啶，主要在胞嘧啶-鸟苷二核苷酸(CpG)中。这种CpG位点以低于人类总基因组中的预期频率而发生，但更常见于称为CpG岛的小长度DNA中。这些岛通常存在于基因的启动子区域(在此处转录起始)中或附近。与基因组DNA(其大部分在CpG位点处甲基化)不同，正常的体细胞启动子和种系组织中的CpG岛保持未甲基化，导致基因表达。DNA甲基化由高度相关的一组DNA甲基转移酶(DNMT)介导，DNMT将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移至CpG二核苷酸中的胞嘧啶。由DNMT建立的甲基胞嘧啶充当MeCP2蛋白的甲基-CpG结合结构域(MBD)，即MBD的结合位点。MBD翻译甲基化DNA染色质环境，该甲基化DNA染色质环境对转录具有压抑性，并通过与组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶和ATP依赖性染色质重塑酶的相互作用得以压缩。特别地，MBD是MeCP2蛋白的甲基CpG结合结构域，其结合至任意序列中对称甲基化的CpG并参与介导甲基化依赖性转录抑制。尽管有强有力的证据表明MeCP2在体内仅与甲基化的DNA片段结合，MeCP2在体外的DNA甲基化非依赖性结合活性也得到一致的记录，该活性可以适当地用于一般的体外DNA分析。最近，高纯度纯化核酸的使用在诸如生物技术、诊断医学、药物医学和代谢医学的各种领域中一直在增加，因此一直在努力更快速地并且更纯地从各种生物样品中分离核酸。然而，到目前为止在分离核酸的方法中与载体相关的技术已经发展得很好，所述载体从细胞裂解溶液中包含的各种物质(例如基因组DNA、质粒DNA、信使RNA、蛋白质、细胞碎片颗粒)中仅特异性地吸附核酸，并且几乎所有的研究都集中在吸附核酸的材料的研究和开发上。因此，为了更快速且纯地分离核酸，更需要开发能够从细胞碎片颗粒、蛋白质变性聚集体和各种其它细胞降解物质中仅快速分离所需核酸的技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种提取核酸的方法及其设备，与使用所有需要大型设备(离心机和磁体等)的用于核酸提取的商品化试剂盒(包括传统Qiagen)提取核酸的方法相比，该方法能够简单且低成本地从各种核酸来源中提取大量且高纯度的核酸。技术方案为了解决上述问题，本专利技术提供了一种提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象中进行改性(步骤1)；通过将核酸样品和由以下化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成核酸和化合物的复合物(步骤2)；以及，通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取核酸(步骤3)。另外，本专利技术提供了用于提取核酸的薄膜设备，所述薄膜设备包含：上层薄膜，所述上层薄膜具有分别穿过其的入口孔和出口孔；下层薄膜，所述下层薄膜与所述上层薄膜分开设置；微通道室，在所述微通道室中以内部图案的形式形成微通道，在所述微通道中入口端和出口端分别对应于所述上层薄膜的入口孔和出口孔并与其连通，并且注入路径在邻近所述入口端处形成，所述注入路径与所述微通道的入口连通，所述微通道室设置在所述上层薄膜和所述下层薄膜之间；以及，密封装置，所述密封装置用于密封所述上层薄膜和所述下层薄膜的每一侧，以密封所述微通道室。另外，本专利技术提供了用于提高核酸提取效率的组合物，所述组合物包含由下述化学式1表示的化合物作为活性成分：[化学式1]其中，n为5至10的整数。有益效果根据本专利技术的提取核酸的方法可容易且快速地从各种核酸来源(包括真核细胞、细菌、病毒细胞或体液)提取核酸，并且使用用于核酸提取的薄膜设备时，相比传统硅基材而言，可通过改善亲水性更有效地提取核酸。附图说明图1为用于核酸提取的HINT(用于使用薄膜进行核酸提取的同型双官能亚氨酸酯类(HI)，homobifunctionalimidoesters(HIs)fornucleicacidsextractionusingthinfilms)系统的原理的示意图。图2为示出了薄膜设备结构的分解视图。图3为示出了根据二甲基辛二酰亚胺酯(DMS，dimethylsuberimidate)浓度的DNA提取效率的图表。图4为示出了使用乳腺癌细胞的根据本专利技术的DTS分析、传统Qiagen试剂盒以及使用二甲基己二酰亚胺酯(DMA，dimethyladipimidate)的分析的DNA提取效率的结果的图表，所述DMA为与DTS分析中使用的DMS类似的化合物。图5为示出了根据本专利技术的DTS分析和根据使用DMA(与DTS分析中使用的DMS类似)的分析所提取的DNA的PCR扩增效率的图表。图6为具体示出了微流体室的视图。图7示出了用于RNA提取和DNA提取的HINT系统的基本特征。(A)投入的DNA(1μg人基因组DNA)与HI[二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)或二甲基庚二酰亚胺酯(DMP，dimethylpimelimidate)]的回收量。(B-C)使用不同浓度的DMS(100mg/mL、50mg/mL、20mg/mL和10mg/mL)从细胞(HCT116，结肠直肠癌细胞系)中提取的DNA的量(B)和纯度(C)。(D)用由系统提取的两种浓度(1×103和1×106)RNA进行的RNA的18S基因扩增。(E)根据DMS浓度(50mg/mL-250mg/mL)，用由系统提取的DNA进行的肌动蛋白基因扩增。L：DNA大小标记物；Q：用Qiagen试剂盒提取的RNA；N：阴性对照。图8示出了HINT系统用于癌细胞系RNA提取的应用。(A-C)对于(A)AGS(胃癌细胞系)细胞、(B)HCT116(结肠直肠癌细胞系)细胞和(C)MCF7(乳腺癌细胞系)细胞，HINT系统的能力。(D)由提取的RNA中PCR扩增18S基因。(E)根据单步逆转录RT-PCR中HCT116细胞的浓度对循环数(CT)进行确认的结果。图9示出了HINT系统用于癌细胞系DNA提取的应用。(A-B)对于(A)AGS(胃癌细胞系)和(B)HCT116(结肠直肠癌细胞系)，HINT系统的DNA提取的能力。(C)根据HCT116细胞的浓度，对通过应用DMS由HINT系统提取的DNA的RT-PCR循环数进行确认的结果。(D)采用不同大肠杆菌(E.coli)浓度由HINT系统提取的DNA的RT-PCR分析。图10示出了在临床样品中HINT系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取核酸的方法，所述方法包括：步骤1：通过将胺基引入对象中进行改性；步骤2：通过将核酸样品和由下述化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成所述核酸和所述化合物的复合物；以及步骤3：通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取所述核酸，[化学式1]

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.17 KR 10-2016-0060310;2016.12.21 KR 10-2011.一种提取核酸的方法，所述方法包括：步骤1：通过将胺基引入对象中进行改性；步骤2：通过将核酸样品和由下述化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成所述核酸和所述化合物的复合物；以及步骤3：通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取所述核酸，[化学式1]其中，n为5至10的整数。2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述化学式1中，n为5至7的整数。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象为薄膜设备、磁珠和纳米颗粒中的任一种。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为DNA或RNA。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为甲基化DNA。6.如权利要求1所述的方法，其中，通过在所述对象中引入硅烷化合物进行所述改性。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述硅烷化合物为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述步骤1之前通过等离子体处理对所述对象进行洗涤。9.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸样品为真核细胞、细菌细胞、病毒细胞、全血或尿液来源的样品。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述步骤2中在所述经改性的对象上囊括蛋白酶和洗脱缓冲剂。11.一种用于提取核酸的薄膜设备，所述薄膜设备包含：上层薄膜，所述上层薄膜具有分别穿过其的入口孔和出口孔；下层薄膜，所述下层薄膜与所述上层薄膜分开设置；微通道室，在所述微通道室中以内部图案的方式形成微通道，所述微通道中的入口端和出口端分别对应于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：慎镛，
申请(专利权)人：蔚山大学校产学协力团，财团法人峨山社会福祉财团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR