一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。本发明专利技术开发了一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，通过对提取溶剂的选择优化，利用乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液作为提取液，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的样品前处理方法。本发明专利技术方法在低温条件下对线虫样品代谢物进行充分的提取，可降低高温条件对代谢物结构的影响，通过除去脂溶性的次级代谢物避免了次级代谢物对仪器的污染干扰，所得的代谢物峰数据丰富。该方法可应用于以线虫为研究模型的现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，特别是以GC‑MS作为分析工具的代谢组学研究。

A Sample Pretreatment Method for Metabonomics Analysis of Caenorhabditis elegans

The invention discloses a sample pretreatment method for metabolomics analysis of Caenorhabditis elegans, which belongs to the field of chemical analysis and detection. The invention develops a pretreatment method for metabolomics analysis of Caenorhabditis elegans. By selecting and optimizing the extraction solvent, using the mixed solution of acetonitrile, isopropanol and sterile water as the extraction solution, a sample pretreatment method with strong versatility, sufficient extraction, high extraction selectivity and good reproducibility is obtained. The method of the invention can fully extract metabolites of nematode samples under low temperature conditions, reduce the influence of high temperature conditions on the structure of metabolites, avoid the pollution interference of secondary metabolites on instruments by removing lipid-soluble secondary metabolites, and obtain abundant metabolite peak data. This method can be applied to modern developmental biology, genetics, genomics, environmental toxicology, etc. with nematodes as research models, especially metabolomics with GC MS as analytical tool.

【技术实现步骤摘要】
一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法
本专利技术涉及一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。
技术介绍
秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的成虫体长约1-1.5mm的新模式生物，主要以细菌为食物，具有体积小、容易培养、生长周期短、保存简便等特点。秀丽隐杆线虫拥有高等生物衰老的一般性特征，如行动力减缓、肌肉萎缩等，是近年来衰老研究中最重要的非脊椎类模式生物之一。研究数据表明，线虫高度类似哺乳动物，至少38％的线虫蛋白表达基因被证明与人类基因有直接同源性，60％-80％的人类基因均可在线虫基因组中找到同源基因，其中含与人类疾病相关的40％比例的基因。因此，秀丽线虫被广泛应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，而在毒理评价以及药物筛选中应用最为广泛。代谢组学(Metabonomics/mebabolomics)是研究生物体系在受到外界不同刺激或干扰(基因改造或外部环境变化等)前后等特定条件下的代谢产物(分子量<1000)的种类、数量和变化规律的科学，能够分析机体局部的一条代谢通路，是一种新型的系统生物学重要组成部分。代谢组学与其它组学相比，可以从代谢物层面上对生命活动进行探究，通过分析内源性代谢物的调节以及与整体生物学状况的关系，找出生物标记物，从而找出外界环境对引起生物体变化的可能途径。因此，通过对线虫代谢组研究，不仅可以了解线虫在不同环境条件下的变化，还可以进行以线虫为载体在药物等物质暴露条件下的毒理以及功效等的评价，并提供准确的代谢物组分和含量。高通量的代谢组学研究要求检测分析技术具有高灵敏度、高分辨率、无偏性和良好的重现性。气相色谱质谱联用仪(GC-MS)是基于质谱的主要检测平台之一，是代谢组学研究中应用最早的分析技术，也是最为成熟的色谱-质谱联用技术之一，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、重现性好、有较高的分析速度、标准代谢物图库丰富等优点，在分析相对分子质量小、极性和沸点低的代谢物或衍生化后在具有挥发性的物质有明显优势。此外，GC-MS仪器相对便宜，且有较为完整的人体代谢质谱数据库(HMDB)，物质鉴定起来相对便捷，尤其适用于分析多组分混合物中未知成分的定性分析，可准确判断化合物的分子式，能够鉴别甚至未分离的色谱峰。但目前基于GC-MS分析的线虫代谢组学样本前处理方法通用性不强，缺少对方法的优化，提取不够充分，难以实现高通量全范围的检测分析。在对药物筛选、毒理评价等研究时，对于性质或者含量差异较大的物质难以实现同步检测，提取的选择性较低，物质丰度低。因此，优化一种线虫样本前处理方法，将为科研人员研究以线虫为模型的代谢组学分析提供方便。
技术实现思路
本专利技术主要侧重于优化秀丽隐杆线虫基于GC-MS的代谢组学分析的样品前处理的提取方法通过对提取溶剂的选择优化，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的基于GC-MS代谢组学分析的秀丽隐杆线虫样品预处理方法。本专利技术的第一个目的是提供一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。在本专利技术的一种实施例中，所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。在本专利技术的一种实施例中，所述猝灭液为甲醇和无菌水的混合溶液。在本专利技术的一种实施例中，所述猝灭液中甲醇和无菌水的体积比为(1～3)：1。在本专利技术的一种实施例中，所述猝灭方法包括将猝灭液与线虫样品混合进行猝灭，线虫样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。在本专利技术的一种实施例中，所述提取方法包括将提取液与线虫猝灭液混合后，加入钢珠组织进行破碎，然后超声提取。在本专利技术的一种实施例中，所述线虫代谢产物提取方法具体包括：将线虫猝灭液放于冰上，加入-20℃预冷的提取液；加入钢珠于离心管中，置于组织破碎机中进行细胞破碎，超声提取；用吸铁石吸出钢珠、离心；取上清液，多次重复，合并上清液。在本专利技术的一种实施例中，所述提取液与线虫样品的体积比为1：1～1：4。在本专利技术的一种实施例中，所述破碎机是在1200～1800rpm，20～40s，6～9cycle条件下进行细胞破碎。在本专利技术的一种实施例中，所述钢珠直径1～3mm。在本专利技术的一种实施例中，所述无菌水用高温高压蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌得到。在本专利技术的一种实施例中，所述淬灭方法具体包括：将甲醇和无菌水按照(1～3)：1的体积比混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下使用，然后与线虫混合进行淬灭。在本专利技术的一种实施例中，所述方法还包括线虫的培养收集、胞内代谢产物干燥和保存。在本专利技术的一种实施例中，所述线虫的培养可以在NGM培养基或者大肠杆菌OP50条件下进行培养。在本专利技术的一种实施例中，所述方法还包括线虫代谢组衍生化。在本专利技术的一种实施例中，所述方法具体包括：(1)线虫同步化：用M9buffer溶液将NGM平板上培养的成虫期线虫轻轻洗下，收集于离心管中，用M9buffer溶液洗涤两边，移去洗涤缓冲液，加入500μL线虫裂解液，振荡5-10min，待虫体裂解后4000rpm/min、4℃离心5min，移去裂解液，用M9buffer溶液洗涤至少2遍，最后用M9buffer溶液重悬虫卵，按每板100μL的量接到涂布有大肠杆菌食物的NMG平板上，生化培养箱中20℃培养60h。(2)收集线虫样本：待线虫培养60h进入L4期后，用M9buffer溶液洗下NGM平板上的线虫，收集到离心管中，用M9buffer溶液洗涤2-3次，用M9buffer溶液稀释虫体密度，计算体积下虫体的数量。然后分装至1.5mL离心管中，1200rpm/min离心，移去溶液。(3)线虫样本猝灭：离心管中加入0.5mL于-20℃预冷的猝灭溶液，猝灭5min后离心，移去上层溶液，得到线虫样品。(4)线虫破碎及代谢组提取：将步骤(3)得到的线虫样品加入配制好的预冷提取溶液，离心管中加入2-3粒钢珠，组织破碎机振荡破碎，然后冰浴下超声辅助提取1-5min，14000rpm/min离心2min，上层清液转移至另一离心管中。重复上述步骤提取2次，合并滤液，真空冷冻浓缩得到提取样品。-80℃保存，待用。(5)线虫代谢组衍生化：步骤(4)所得代谢组提取物质中加入10μL配制浓度为40mg/mL的甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，旋涡振荡使其混合均匀，样品置于金属浴中1200r/min、30℃孵育90min。取出稍冷却后加入92μL含1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)溶液，旋涡混合后继续置于金属浴中1200r/min、37℃孵育30min。衍生化结束后取溶液95μL于装有衬管的色谱进样小瓶装，待进样分析。(6)线虫代谢组分析：步骤(5)中所得代谢组线虫提取溶液进行GC-MS系统分析检测，根据所得图谱进行线虫代谢组分析。上述方案中，所述秀丽隐杆线虫培养用NGM培养基为：1.2gNaCl，1.2g胰蛋白胨，3.5g琼脂粉，蒸馏水溶解后定容至400mL，高温灭菌21min。然后室温冷却至约60℃，依次加入灭菌后溶液：0.4mL乙醇胆固醇、0.4mL1MCaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液；所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。

【技术特征摘要】
1.一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液；所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取方法包括将提取液与线虫猝灭液混合后，加入钢珠组织进行破碎，然后超声提取。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述猝灭液为甲醇和无菌水的混合溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猝灭液中甲醇和无菌水的体积比为(1～3)：1。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猝灭方法包括将猝灭液与线虫样品混合进行猝灭，线虫样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，叶永丽，纪剑，孙嘉笛，黄鹤阳，张银志，皮付伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32