一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L制造技术

本发明专利技术公开了一种重组腺病毒表达载体，所述载体特征包括：以野生型腺病毒SAd23的基因组为基础，通过分子克隆的方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑Ceu I和PI‑Sce I酶切位点，同时以腺病毒人血清型Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞（HEK293）中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。本发明专利技术的优势在于：1.通过直接分子克隆的方法，构建大片段质粒，方法简单，易操作，可以用于任何大片段载体的构建；2.通过几次克隆连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；3.在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

A recombinant adenovirus expression vector SAd23-L

The present invention discloses a recombinant adenovirus expression vector. The vector features include: deleting E1 coding region and E3 coding region by molecular cloning based on the genome of wild adenovirus SAd23, inserting I_Ceu_I and PI_Sce_I digestion sites into E1 deletion region, and replacing E4 coding region of SAd23 with E4 coding region of adenovirus human serotype Ad5, thereby improving human resources. The success rate and titer of recombinant virus were packaged in HEK293, and the replication-deficient recombinant adenovirus expression vector was obtained. The advantages of the present invention are as follows: 1. Construction of large fragment plasmids by direct molecular cloning method is simple and easy to operate, and can be used to construct any large fragment vector; 2. Construction of adenovirus expression vector can be completed by several cloning links, and the steps are simple; 3. Screening positive clones at the bacterial level is easier and faster, and the construction time of adenovirus vector is shortened.

【技术实现步骤摘要】
一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L
本专利技术属于生物
，特别是一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体；具体是本专利技术涉及一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L。
技术介绍
腺病毒（adenovirus,Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初。腺病毒可以在不同动物体内刺激诱导出有效的T细胞和B细胞免疫应答，但是不同型别的腺病毒诱导能力是不相同。C亚群中的腺病毒诱导的针对外源基因的特异性T细胞免疫和B细胞免疫反应最强。基于腺病毒人血清型5（Ad5）和2（Ad2）型的表达载体在疫苗研究以及治疗中被广泛应用，但是由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法转运重组Ad5载体；（2）对Ad5载体进行基因工程改造；（3）从其它人腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。该方法具体是以源于黑猩猩型腺病毒23型，改造为复制缺陷型的腺病毒载体。但是，之前构建的基于黑猩猩型腺病毒的表达载体，都需要在人源肾胚细胞中完成病毒的包装，由于种属的差异性，包装出的重组病毒无论是滴度还是纯度都达不到临床使用的标准，跟在人源肾胚细胞包装出的Ad5病毒载体相比有一定差距。CN201710814259.3公开了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。但是，专利技术人在实践中发现，采用这种方法构建的载体Sad23，在包装成功病毒之后，在扩增病毒，准备纯化的过程中遇到困难，病毒感染很多的HEK293细胞之后，回收细胞，冻融细胞，上清氯化铯纯化的病毒总是达不到理想的病毒滴度，Sad23-eGFP病毒感染90个75T的HEK293细胞之后，纯化得到的重组病毒，经过空斑形成实验确定最终的滴度只有109PFU/ml。即Sad23病毒载体在扩增病毒的过程，产生的毒量太低，然后影响其在实际的临床中的应用，因此需要进一步改进。
技术实现思路
为了弥补已有腺病毒表达载体的在病毒滴度低，纯化困难等方面的缺陷，本专利技术提供一种新的重组的腺病毒表达载体本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现。一种重组腺病毒表达载体，其是以野生型腺病毒SAd23的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。其中，野生型腺病毒SAd23的基因组的genebank登录号为AY530877，人血清型腺病毒Ad5基因组的genebank登录号为AY601635.1。进一步地，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第492-3022位的碱基序列。进一步地，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第17895-31909位的碱基序列。进一步地，所述的SAd23的E4编码区是指野生型腺病毒SAd23的基因组中第33841-36181位的碱基序列。进一步地，所述的Ad5的E4编码区是指腺人血清型腺病毒Ad5基因组中第33193-35526位的碱基序列。在另外的一选例中，所述腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间，还包括外源的抗原编码基因。进一步地，所述外源的抗原是寨卡的包膜蛋白E抗原。在本专利技术的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：（1）提供所述的重组腺病毒表达载体；（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间；（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术人成功地基于黑猩猩型腺病毒SAd23构建成一种新型表达载体SAd23-L，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗；（2）本专利技术中的重组腺病毒表达载体是以Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞中包装病毒的成功率和包装出病毒的滴度；（3）本专利技术的重组腺病毒载体，能被广泛应用于疫苗和基因治疗领域；（4）本专利技术中进一步对病毒载体进行改造，以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，发现在包装病毒成功之后，病毒感染HEK293细胞之后，收集细胞，然后冻融细胞液，离心得到的病毒上清，经过氯化铯梯度离心纯化得到重组病毒，发现病毒滴度显著增加。在SAd23-L-eGFP病毒感染52个75T的HEK293细胞之后，氯化铯纯化得到的病毒滴度有1011PFU/ml，不单单感染的细胞减少一半，大大的减少了工作量，节约人力物力，而且，病毒的滴度提取103倍，因此改造之后的病毒更具有实际临床应用价值。附图说明图1为重组腺病毒表达载体SAd23-L的酶切鉴定结果。图2为构建重组腺病毒SAd23-L-eGFP的鉴定结果；其中A：重组腺病毒载体SAd23-L-eGFP的酶切鉴定结果；B：重组腺病毒载体SAd23-L-eGFP的病毒噬斑形成结果。图3为构建重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E的鉴定结果；其中A：SAd23-L-ZIKV-E的酶切鉴定结果；B：SAd23-L-ZIKV-E的病毒噬斑结果；C：WB检测包膜E蛋白抗原的表达。图4为构建复制缺陷性腺病毒载体SAd23-L的流程图。图5为SAd23-L-ZIKV-E重组病毒免疫BALB/c小鼠诱导良好的细胞免疫反应；其中，A：免疫小鼠实验分组；B：诱导良好的细胞免疫反应。图6为氯化铯离心纯化的SAd23-L-ZIKV-E的病毒。具体实施方式本专利技术提供了一种重组腺病毒表达载体，所述表达载体包括：在野生型腺病毒SAd23的基因组基础上删除E1和E3编码区，且在E1删除区插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI，同时以Ad5的E4编码区替换野生型腺病毒SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞（HEK293）中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度。其中，野生型腺病毒SAd23的E1编码区的核苷酸序列如GenBank:AY530877.1中第492-3022位的碱基序列；野生型腺病毒SAd23的E3编码区的核苷酸序列如GenBank:AY530877.1中第27895-31909位的碱基序列；野生型腺病毒SAd23的E4编码区的核苷酸序列如GenBank:AY530877.1中第33841-36181位的碱基序列；腺病毒人血清型5（Ad5）型的E4编码区的核苷酸序列如GenB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组腺病毒表达载体，其特征在于，以野生型腺病毒SAd23的全基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑Ceu I和PI‑Sce I酶切位点，同时以腺病毒人血清型5型（Ad5）的E4编码区替换SAd23的E4编码区，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒表达载体，其特征在于，以野生型腺病毒SAd23的全基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以腺病毒人血清型5型（Ad5）的E4编码区替换SAd23的E4编码区，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第492-3022位的碱基序列。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第27895-31909位的碱基序列。4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的SAd23的E4编码区是指野生型腺病毒SAd23的基因组中第33841-36181位的碱基序列。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗升学，刘博超，马晓瑞，张攀丽，
申请(专利权)人：广州佰芮慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44