The invention relates to a method for improving the output of binary acid by using traceless editing technology. The application of traceless editing vector of Candida tropicalis genome based on RISPR_Cas9 in improving binary acid production. The nucleotide sequence of traceless editing vector of Candida tropicalis genome based on RISPR_Cas9 is shown in SEQ ID NO.1. The vector constructed by the invention comprises Cas9, sgRNA, homologous arm, forward screening marker and prokaryotic replication initiation site. After detection, the recombinant strain prepared by the method can greatly increase the production of dibasic acid, lay a foundation for industrial production of dibasic acid, and provide application reference for traceless editing of other microbial genes such as yeast, Corynebacterium glutamate, Escherichia coli and so on.
【技术实现步骤摘要】
一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法
本专利技术涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法,属于生物工程
技术介绍
长链二元酸(Long-chaindicarboxylicacid,DCA)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸,包括不饱和二元酸。它们是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品,是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料,同时也可作为生产不10-HDA、羟基脂肪酸、不饱和二元酸等脂肪酸衍生物的原料。目前长链二元酸的生产主要依赖微生物发酵法获取。微生物发酵法主要依赖于微生物特有的氧化能力及其胞内酶的作用,通过增强α及ω氧化的方法,阻断二元酸分解途径,在常温常压下将油脂或者烷烃或者一元羧酸等为生产原料转化为二元羧酸的技术。最初长链二元酸生产技术自20世纪60年代兴起,随后日本、美国和德国等国家开始由相关技术的基础理论研究转入应用开发研究,主要涉及十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)和十六碳二元酸(DC16)的生产。目前国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化,生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009 ...
【技术保护点】
1.基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用,所述基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用,所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤如下:(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞;(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后,进行电转化,制得转化细胞;(3)将转化细胞复苏培养后,在含G418浓度800~1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养,筛选抗G418的菌株;(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5~15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养,制得编辑后的细胞;(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6~8d,经分离、纯化,制得二元酸。3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candidatropicalis)CICC1798。4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下:取热带假丝酵母单菌落,培养至菌体浓度OD600为1.0~1.8,置于冰上冷却,离心,用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3~5次,电转缓冲液重悬菌...
【专利技术属性】
技术研发人员:范翰,修翔,汪俊卿,王瑞明,李丕武,杨晓慧,薛乐,张丽华,
申请(专利权)人:齐鲁工业大学,
类型:发明
国别省市:山东,37
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