Circ-CDH1抑制剂的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ‑CDH1抑制剂的应用。具体涉及了一种环状RNA Circ‑CDH1核酸分子及其表达的蛋白Circ‑CDH1‑28KD的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是针对Circ‑CDH1‑28KD设计了单克隆抗体Anti‑Circ‑CDH1，其能够特异性的检测细胞内源性环状RNA Circ‑CDH1编码的蛋白质的含量，同时可以显著抑制脑胶质瘤、乳腺癌等肿瘤细胞的侵袭转移，该单克隆抗体在肿瘤的临床检测及侵袭转移治疗中具有广阔的应用前景。

Application of Circ-CDH1 Inhibitor

The invention belongs to the field of gene engineering antibody drug development, and relates to the application of Circ_CDH1 inhibitor. The application of a cyclic RNA Circ CDH1 nucleic acid molecule and its expressed protein Circ CDH1 28KD inhibitor in the preparation of anti-cancer drugs was specifically involved. In particular, the monoclonal antibody Anti Circ CDH1 was designed for Circ_CDH1_28KD, which can specifically detect the content of protein encoded by endogenous cyclic RNA Circ_CDH1, and significantly inhibit the invasion and metastasis of glioma, breast cancer and other cancer cells. The monoclonal antibody has broad application prospects in clinical detection and treatment of invasion and metastasis of tumors.

【技术实现步骤摘要】
Circ-CDH1抑制剂的应用
本专利技术属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ-CDH1抑制剂的应用。
技术介绍
自2012年以来，在生物体内陆续发现了大量存在的环状的RNA(circulaRNA，circRNA)，生物体内的环状RNA是一类具有特殊功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。以前的研究由于技术水平的限制，没有发现这部分环状RNA的客观存在，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环状RNA的具体功能和作用分子机制的研究报道较少，目前只有几种假定的说法：环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因(E-cadheringene.CDH1)是位于染色体16q22.1的一种肿瘤抑制基因。CDH1基因编码了上皮钙粘蛋白或E-钙粘蛋白。这种蛋白质存在于围绕上皮细胞的膜内，上皮细胞是沿着身体和腔肠表面排列的细胞。E-钙粘蛋白属于钙粘蛋白的蛋白质家族，其功能是帮助相邻细胞彼此粘附(细胞粘附)以形成正常的组织。E-钙粘蛋白是研究最彻底的钙粘蛋白之一。除了其在细胞粘附中的作用，E-钙粘蛋白参与细胞内化学信号传递，控制细胞成熟和运动，以及调节某些基因的活性。E-钙粘蛋白还是肿瘤抑制蛋白，它防止细胞生长和分裂太快或以不受控制的方式分裂。已经发现，多种癌症与该基因的功能丧失相关，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的抗肿瘤药物。本专利技术的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂在制备抗肿瘤药物的应用。本专利技术的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段在癌症筛查/诊断或预测中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供抗Circ-CDH1-28KD的抗体。本专利技术的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733特异性的siRNA。本专利技术的另一个目的在于提供一种脑胶质瘤的治疗系统。本专利技术的另一个目的在于提供针对脑胶质瘤治疗的药物研发方法。一方面，本专利技术提供了Circ-CDH1-733抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。进一步地，所述的Circ-CDH1-733抑制剂为Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂或者Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂。非显而易见地，专利技术人在脑胶质细胞系U251中识别发现了一种环化模式的CDH1变异体，此环化模式的变异体是由CDH1基因的第7、8、9、10外显子通过首尾环化形成，由733个核苷酸组成。我们命名Circ-CDH1-733(见图1)，具体地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段的序列如SEQIDNO：1所示，其circBaseID名为：hsa_circ_0039992。通过sangerDNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。CDH1形成环状RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码254个氨基酸，蛋白分子量约28KD，我们命名Circ-CDH1-28KD(见图3)，具体地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段的序列如SEQIDNO：2所示。虽然，已经报道了多种肿瘤与CDH1基因的突变有关，但是，此前，从未有人发现该环状RNACirc-CDH1-733，及其表达的蛋白的存在。更未见人报道Circ-CDH1的基因与脑胶质瘤有关。令人惊喜的是，专利技术人通过制备特异性的抗Circ-CDH1-28KD的单克隆抗体anti-CDH1-28或者是siRNA干扰Circ-CDH1-733，结果发现该抗体或siRNA可以显著地抑制肿瘤细胞的增长，表明了抑制该环状RNA或其表达的蛋白可以抑制肿瘤的增长。该Circ-CDH1-733是由CDH1基因的第7、8、9、10外显子通过首尾环化形成，由733个核苷酸组成。而CDH1基因在多种肿瘤中均有转录。在这些转录CDH1基因的肿瘤中，均有可能产生Circ-CDH1-733。除了脑胶质瘤，专利技术人还在乳腺瘤等多种肿瘤类型中发现了Circ-CDH1-733。其中，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为抑制Circ-CDH1-733核酸片段整体的或局部表达的物质。作为一种可选的实施方案，所述的核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体。所述核酸效应分子可以是单链的或双链的。可以使用衍生自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒或者衍生自各种细菌质粒的表达载体来将核苷酸序列递送至所靶器官、组织或细胞群。可以使用这样的构建体来将不可翻译的正义或反义序列引入到细胞中。甚至在不存在整合到DNA中的情况下，此类载体也可以继续转录RNA分子直至它们由于内源核酸酶而丧失能力。所述核酸效应分子可以选自能够抑制Circ-CDH1-733表达的小的抑制核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)，microRNA(miRNA)，核酶，以及小发夹RNA(shRNA)，这些都能减弱或消除Circ-CHD1-733和/或Circ-CDH1-28KD肽段的表达。这些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二链，二者杂交彼此形成一个或多个双链区，每条链大约18～28个核苷酸的长度，大约18～23个核苷酸的长度，或者18，19，20，21，22个核苷酸的长度。另外，单链也可能包含能够相互杂交形成双链的区域，例如在shRNA分子中。这些小的抑制核酸分子在保持这种减弱或消除Circ-CHD1-733和/或Circ-CDH1-28KD肽段的表达的能力时，可能包括修饰性核苷酸。修饰性核苷酸可用于改善体外或体内特性，如稳定性、活性和/或生物利用度。举个例子，这些修饰性核苷酸可能含有脱氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸和/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干扰RNA(siRNA)，也可能含有5’-和/或3’-帽结构，以此来防止核酸外切酶对其降解。在一些实施例中，小抑制核酸分子组成的双链核酸含有两端钝、或悬垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括会导致错位、凸起、循环、或摆动碱基对的核苷酸。小抑制核酸分子可以设计配方以便施用，例如，通过脂质体包裹，或掺入其他载体(如可生物降解聚合物水凝胶，或环糊精)。优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQIDNO：9而设计获得。在一些实施例中，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为siRNA。作为优选的实施方式，所述的抑制剂系针对于Circ-CDH1-733环状接口而设计；优选地，针对Circ-CDH1-733第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Circ‑CDH1‑733抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述的Circ‑CDH1‑733抑制剂为Circ‑CDH1‑733核酸片段抑制剂或者Circ‑CDH1‑28KD肽段抑制剂。

【技术特征摘要】
1.Circ-CDH1-733抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述的Circ-CDH1-733抑制剂为Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂或者Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为CDH1突变的肿瘤；优选地，所述的CDH1突变的肿瘤为表达环状Circ-CDH1-733并翻译相应蛋白的肿瘤；更优选地，所述的表达环状Circ-CDH1-733并翻译相应蛋白的肿瘤为：脑胶质瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌中的一种或多种；特别优选地，所述的肿瘤为脑胶质瘤。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Circ-CDH1-733核酸片段的序列如SEQIDNO：1所示；优选地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段的序列如SEQIDNO：2所示。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为核酸效应分子；优选地，所述的核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体；优选地，所述的核酸效应分子抑制Circ-CDH1-733整体或局部的表达；优选地，所述的核酸效应分子选自siRNA，dsRNA，miRNA，核酶，以及shRNA中一种；优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQIDNO：9而设计获得；优选地，Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为siRNA；优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-CHD1-733环状接口而设计；更优选地，针对Circ-CHD1-733第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-CHD1-733第716位至17位的序列互补；更优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-CHD1-733的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-CHD1-733的以下序列互补：a)包含Circ-CHD1-733第721位至第8位的序列；b)包含Circ-CHD1-733第728位至第16位的序列；c)包含Circ-CHD1-733第727位至第15位的序列；更优选地，所述的siRNA选自SEQIDNO：6-8中的任意一条；优选地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体；优选地，所述的抗体是针对氨基酸序列SEQIDNO：3的抗体；优选地，所述的抗体是以SEQIDNO：3作为免疫原制备单克隆抗体而得。6.Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段的检测试剂在制备癌症筛选/诊断/预测/预后诊断剂或诊断系统中的应用。7.一种脑胶质瘤治疗系统，其特征在于，包括：1)Circ-CDH1-733和/或Circ-CDH1-28KD检测系统；2)用药系统；优选地，所述的用药系统含有Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂；优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为核酸效应分子；优选地，所述的核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体；优选地，所述的核酸效应分子抑制Circ-CDH1-733的表达；优选地，所述的核酸效应分子选自siRNA，dsRNA，miRNA，核酶，以及shRNA中一种；优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQIDNO：9而设计获得；优选地，Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为siRNA；优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-CHD1-733环状接口而设计；更优选地，针对Circ-CHD1-733第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-CHD1-733第716位至17位的序列互补；更优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-CHD1-733的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-CHD1-733的以下序列互补：a)包含Circ-CHD1-733第721位至第8位的序列；b)包含Circ-CHD1-733第728位至第16位的序列；c)包含Circ-CHD1-733第727位至第15位的序列；还更优选地，所述的siRNA选自SEQIDNO：6-8中的任意一条；优选地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物；更优选地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体；更...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弩，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东,44