一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，本发明专利技术的方法包括：第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培养基对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第6天对上一步诱导培养后的细胞进行消化，然后采用内皮细胞培养基继续培养3～4天。本发明专利技术分化内皮细胞的方法更加的经济有效，分化过程更加方便快捷；分化过程中不使用血清，排除多种因素的干扰，并且分化结果更可靠；且添加RA可以促进内皮分化的效率，一次分化可以得到更多的内皮细胞。

A Method to Promote Directional Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Endothelial Cells

The invention discloses a method for promoting the directional differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells. The method of the invention includes: on day 0-1, the differentiation of human pluripotent stem cells with cell density of more than 95% is induced by using a CDM 3 differentiation medium supplemented with GSK3I of 4-8 mu M; on day 2, the further induced differentiation of human pluripotent stem cells is refined by using a CDM 3 differentiation medium supplemented with 40-60 ng/ml bFGF. Cells were further induced to differentiate; CDM3 medium supplemented with 40-60 ng/ml of VEGF and 20-30 ng/ml of BMP 4 was used to further induce cell differentiation on day 3-5; cells after further induction were digested on day 6, and then cultured on endothelial cell medium for 3-4 days. The method for differentiating endothelial cells in the present invention is more economical and effective, and the process of differentiation is more convenient and fast; the serum is not used in the process of differentiation, the interference of various factors is eliminated, and the result of differentiation is more reliable; and the addition of RA can promote the efficiency of endothelial differentiation, and more endothelial cells can be obtained by one differentiation.

【技术实现步骤摘要】
一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法
本专利技术涉及一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，属于细胞培养

技术介绍
血管疾病影响数百万人的健康。严重的血管疾病导致截肢和危及生命的中风。在所有血管腔内排列的内皮细胞在调节血管通透性，血管生成和组织再生起着至关重要的作用。在生理条件下，血管可以通过血管发生和血管生成产生。血管发生是指从祖细胞形成新血管，而血管生成是指通过现有血管细胞的迁移和增殖从现有血管形成新血管。然而，这些过程在患有中风，糖尿病或老年痴呆症的患者中受到损伤。在血管疾病中，由于内皮细胞的异常病变或者死亡导致血管功能恶化，最近有研究表明，内皮细胞具有形成血管的能力，且对于改善血管疾病有很大的帮助，因此，需要获得大量的人源的内皮细胞来治疗这些血管疾病。人多能干细胞，例如人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)，能够自我更新并分化成人体中的任何细胞类型，因此是产生内皮细胞(ECs)的理想资源。许多研究小组已经证明ECs可以来源于hiPSCs和hESCs。这些诱导得到内皮细胞可用于自体的缺血区域的血管重建和定制人造血管和组织,另外，体外利用多能干细胞分化内皮细胞也为研究调控内皮命运的分子机制提供了新的途径。通过机制研究有助于理解血管疾病的发病机制以及为治疗血管疾病提供有效的措施。然而，在开发临床应用之前，必须建立从多能干细胞中获得ECs的低成本且高效的方法。此外，需要进一步探索调控多能干细胞分化内皮细胞的机制。目前分化内皮祖细胞的方法有很多种，但普遍存在分化的过程复杂，分化周期长，成本较高，分化不稳定等缺点。首先，在贴壁细胞分化方法中：2015年，GopμSriram等，使用StemDiffAPEL，ECGM-MV2等分化培养基，连续添加BMP4、FGF2、VEGF的情况下，获得CD31/CD144双阳性的细胞比例为80.7％。但是此方法所用StemDiffAPEL、ECGM-MV2分化培养基价格过高，使分化成本大大增加。2017年，KitManTsang等，在连续七天的缺氧条件下，使用BMP4、FGF2、VEGF，使得内皮的分化效率由常氧下的12.4％提升为29.3％。在悬浮细胞分化的条件下，2010年，HongkuiDeng等，使用EB分化的方式，在七天的过程中，使用BMP4，VEGF的方法，获得27％的CD34阳性的祖细胞。目前，关于分化内皮细胞存在以下缺陷：成本过高，mTeSR培养基，StemDiffAPEL，ECGM-MV2培养基价格过高，不适合大量培养和分化内皮细胞；现有技术分化效率低，得率低。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，本专利技术的方法降低了人胚胎干细胞和人多能诱导干细胞体外诱导内皮细胞的成本，并进一步用视黄酸RA提高内皮细胞的分化效率，在一次分化过程中获得更多的内皮细胞。本专利技术的第一个目的是提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)在第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培养基，对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；(2)在第2天，使用添加40～60ng/mlbFGF的CDM3分化培养基对步骤(1)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(3)在第3～5天，使用添加40～60ng/mlVEGF和20～30ng/mlBMP4的CDM3分化培养基对步骤(2)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(4)在第6天，添加细胞消化酶对步骤(3)诱导培养后的细胞进行消化，然后将消化后得到的细胞采用内皮细胞培养基继续培养3～4天；所述的CDM3培养基中含有RPMI-1640基础培养基、双抗、牛血清白蛋白和抗坏血酸。进一步地，在步骤(2)中，在添加bFGF的同时加入0.8～1.2μM视黄酸(RA)。进一步地，所述的人多能干细胞为人胚胎干细胞(hESCs)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)。进一步地，在步骤(1)之前，还包括采用干细胞培养基对人多能干细胞进行传代培养至细胞密度达到95％以上。进一步地，所述的干细胞培养基为PSeasy-E8或mTeSR。进一步地，所述的培养和传代具体包括如下步骤：将人多能干细胞培养至细胞密度到达85～90％后，使用无钙磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗细胞碎片，随后加入0.5μM的EDTA，消化5～10min，然后将细胞吹散，吹散后按照1:6～1:10的比例传代至Matrigel包被的培养皿中，继续培养至细胞密度为95％以上。进一步地，在步骤(1)中，所述的GSK3I为CHIR99021。进一步地，所述的CDM3培养基中牛血清白蛋白的浓度为0.4～0.6mg/ml，抗坏血酸的浓度为0.20～0.25mg/ml，所述的双抗为青霉素和链霉素，其中青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为0.1mg/ml。进一步地，所述的细胞消化酶为胰酶细胞消化液或Accutase细胞消化液。进一步地，所述的内皮细胞培养基为ECM培养基。进一步地，在步骤(4)中，消化后得到的细胞接种至Gelatin包被的培养皿中进行培养。采用Gelatin包被的培养皿有利于辅助细胞贴壁，有利于内皮细胞生长。在本专利技术中，第0天指的是0～24h，第1天指的是24～48h，以此类推。本专利技术的有益效果是：本专利技术分化内皮细胞的方法更加的经济有效，分化过程更加方便快捷；分化过程中不使用血清，排除多种因素的干扰，并且分化结果更可靠；且添加RA可以促进内皮分化的效率，一次分化可以得到更多的内皮细胞。附图说明图1为未分化的胚胎干细胞的显微照片；图2为添加RA与对照组在第6天的分化效率流式对比；图3为添加RA与对照组在第10天的分化效率流式对比；图4为第十天经过CD144磁珠纯化后的内皮细胞流式图；图5为纯化后的内皮细胞免疫荧光染色。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1：定向分化的诱导因子和小分子化合物诱导因子：CHIR99021，作用浓度6μM；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),作用浓度100ng/μl；血管内皮细胞生长因子(VEGF)，作用浓度50ng/μl；骨形成蛋白4(BMP4)，作用浓度25ng/μl；小分子化合物：视黄酸(RA)，作用浓度1μM。实施例2：胚胎干细胞的培养和传代在Matrigel包被的培养皿上，使用PSeasy-E8培养基培养人胚胎干细胞(hESCs)，当细胞汇合度达到80％及以上时，吸走培养基，加入DPBS洗一次；加入EDTA，37℃很稳培养箱中孵育3-5分钟；吸去消化液，立即加入新鲜的PSeasy-E8培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀。然后按照1:8或者1:10的比例将细胞传至新的采用Matrigel包被的细胞培养板中，使用Pseasy-E8培养基进行传代培养，传代后的前24h，培养基中加入含10μMROCK-I(Y27632),随后每天更换新的培养液，直至下次传代。将未分化的人胚胎干细胞在倒置荧光显微镜下拍照，结果如图1，所示人胚胎干细胞H1系生长在Martrigel包被的培养皿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在第0～1天，使用添加4～8μM GSK3I的CDM3分化培养基，对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；(2)在第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培养基对步骤(1)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(3)在第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培养基对步骤(2)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(4)在第6天，添加细胞消化酶对步骤(3)诱导培养后的细胞进行消化，然后将消化后得到的细胞采用内皮细胞培养基继续培养3～4天；所述的CDM3培养基中含有RPMI‑1640基础培养基、双抗、牛血清白蛋白和抗坏血酸。

【技术特征摘要】
1.一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在第0～1天，使用添加4～8μMGSK3I的CDM3分化培养基，对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；(2)在第2天，使用添加40～60ng/mlbFGF的CDM3分化培养基对步骤(1)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(3)在第3～5天，使用添加40～60ng/mlVEGF和20～30ng/mlBMP4的CDM3分化培养基对步骤(2)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；(4)在第6天，添加细胞消化酶对步骤(3)诱导培养后的细胞进行消化，然后将消化后得到的细胞采用内皮细胞培养基继续培养3～4天；所述的CDM3培养基中含有RPMI-1640基础培养基、双抗、牛血清白蛋白和抗坏血酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在添加bFGF的同时加入0.8～1.2μM视黄酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括采用干细胞培养基对人多能干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡士军，雷伟，杨壮壮，赵振奥，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32