一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，包括以下步骤：(1)取出小公猪睾丸组织浸润；(2)用PBS缓冲液清洗；(3)加入细胞培养液培养，离心去上清；(4)加入透明质酸酶和胶原酶IV震荡，加入细胞培养液离心去上清；(5)加入胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶震荡，加入细胞培养液(6)细胞筛过滤；(7)离心去上清液，加细胞培养液；(8)细胞培养传代；(9)将细胞液培养、保存，即得。本发明专利技术的优点是应用效果好、成本低、容易加工生产。

Preparation of an agonist for improving sperm motility of breeding boars

The invention relates to a preparation method of sperm motility agonist for breeding boars, which includes the following steps: (1) taking out testicular tissue of young boars to infiltrate; (2) cleaning with PBS buffer; (3) adding cell culture medium to culture and centrifuge to remove supernatant; (4) adding hyaluronidase and collagenase IV concussion, adding cell culture medium to centrifuge to remove supernatant; (5) adding trypsin and deoxyribonuclease concussion. Dang, add cell culture medium (6) cell sieve filtration; (7) centrifuge the supernatant, add cell culture medium; (8) cell culture and passage; (9) culture and preservation of cell fluid. The invention has the advantages of good application effect, low cost and easy processing and production.

【技术实现步骤摘要】
一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法。
技术介绍
种公猪精子品质在公猪管理工作中有至关重要的作用，精子质量直接关系到猪场的配种受胎率和产仔数，进而影响整个猪场经济效益。种公猪采精后检查精液，有助于了解种公猪精子状态，掌握种公猪的繁殖性能。精子的常规检查包括精液的量、气味、色泽、活力和密度，其中精子活力作为表征公猪精子质量好坏的一个重要指标，应用十分广泛。精子活力是指精液中运动精子所占的百分率。由于只有具有运动的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以精子活力与雌性受胎率密切相关，从而它是目前评定精液品质优劣的常规检查的主要指标之一。如能有效的提高精子活力，势必会提高种猪的繁殖率，进而提高猪场的经济效益。因此，制备能够显著提高种公猪精子活力的激动剂，具有重要意义。目前，提高种公猪精子活力的方法主要为(1)肌肉注射睾丸酮，具体注射方法为一天一次，连续注射三天。(2)人工喂服雅士勇。具体饲喂方法为与脱霉剂，多维素，维生素A、B、D，生育酚，胡萝卜素等混合，搅拌于猪饲料中，连续喂服一周。(3)加强公猪运动，每天喂生鸡蛋，胡萝卜等方法。在利用以上方法提高公猪精子活力的过程中发现：(1)所述的肌肉注射睾丸酮属于雄性激素类药物，注射睾丸酮虽然可使公猪性欲亢进，但长期使用可致公猪睾丸萎缩，精子生成受抑制，还可能会出现红细胞增多，呕吐，皮疹，神经血管性水肿，肝功能异常等副作用，对于公猪产精年限也有一定影响。(2)中雅士勇主要成分为左旋肉碱、天门冬氨酸、VB1、麦氨酸、VB6、甘氨酸等，雅士勇虽然能有有效提高提高种畜禽受精率，降低死淘率，但有研究发现：“雅士勇”口服液对大白猪和长白猪射精量无明显影响，且“雅士勇”为意大利进口种公猪保健品，价格相对较高。(3)中所述加强公猪运动，每天喂生鸡蛋，胡萝卜等方法，实际生产中发现对于提高种公猪精子活力有限，且用时较长。
技术实现思路
针对现有技术提高种公猪精子活力的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种成本低廉、使用方便、效果显著、毒害作用小的提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，本专利技术制备的种公猪精子激动剂，体外使用、应用效果好、成本低、容易加工生产，具有较好的市场前景。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，包括以下步骤：(1)取出小公猪睾丸组织，放入加有1％双抗的37℃生理盐水中浸润10～30min；(2)取出浸润后的公猪睾丸组织，用含有1％双抗的PBS缓冲液清洗三遍；(3)加入DMEM/F12细胞培养液，37℃下培养30min，充分分解睾丸组织，将分散后的组织液转移至离心管中，离心去上清液；(4)在离心管中加入1.5mL透明质酸酶和1.5mL胶原酶IV，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液，离心去上清液；(5)在离心管中加入1.5mL胰蛋白酶和1.5mL脱氧核糖核酸酶，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液；(6)将细胞液依次用80、200、300目的细胞筛过滤；(7)将过滤后的细胞培养液离心去上清液，加入4～6mL的细胞培养液，吹打混匀，转到细胞培养皿中培养2小时后更换新的细胞培养液；(8)将培养皿中的细胞培养传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种0.5～1.5×106个细胞；(9)将细胞液培养8小时后取出，放到-20℃冷冻保存，即得；所述步骤(1)的具体操作为：将小公猪进行麻醉，对小公猪进行去势操作，摘出睾丸，手术剪除去血液和脂肪组织，将睾丸剪碎，把剪碎后的睾丸组织加入含有1％双抗的生理盐水中，在37℃、5％CO2培养箱内孵育10～30min。所述小公猪指出生后7～10日龄内的小公猪。所述步骤(1)、(2)中双抗为含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。所述步骤(3)、(4)中DMEM/F12细胞培养液，是由F12培养基和DMEM培养基以1∶1比例混合均匀制成，适于克隆密度的培养。所述步骤(7)中细胞培养液为RPMI-1640型细胞培养液。所述步骤(8)中，细胞浓度为1×106个/mL。本专利技术双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液中，青霉素的含量为10000U/mL，链霉素的含量为10mg/mL。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mLPBS缓冲液表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养。主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。F12培养基和DMEM以1∶1结合，即称为DMEM/F12培养基。透明质酸酶是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。胶原酶IV是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够特异性的识别Pro-X-Gly-Pro序列(该序列高频率出现在胶原中，很少发现于其他蛋白中)并切割该序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之间的肽键。许多蛋白酶都能水解单链且变性的胶原多肽，但胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。脱氧核糖核酸酶即是DNA酶，用于从蛋白样品中去除DNA，但无法水解紧密的核染色质。本专利技术的有益效果为：本专利技术激动剂体外使用、成本低廉、方便使用、效果显著、毒害作用小，可以有效改善种公猪精子微环境，改善人工授精的效果。同时，本专利技术制备的公猪精子激动剂应用容易加工生产，便于使用，具有长效作用，方便简单，制备过程简单，易于推广使用。附图说明图1为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有激动剂的实验组精子运动轨迹图；图2为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有相同体积生理盐水的对照组精子运动轨迹图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。实施例1一种提高公猪精子活力激动剂的制备方法，通过以下方法制备：(1)取出小公猪睾丸组织，放入加有1％双抗的37℃生理盐水中浸润10～30min；(2)取出浸润后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)取出小公猪睾丸组织，放入加有1％双抗的37℃生理盐水中浸润10～30min；(2)取出浸润后的公猪睾丸组织，用含有1％双抗的PBS缓冲液清洗三遍；(3)加入DMEM/F12细胞培养液，37℃下培养30min，充分分解睾丸组织，将分散后的组织液转移至离心管中，离心去上清液；(4)在离心管中加入1.5mL透明质酸酶和1.5mL胶原酶IV，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液，离心去上清液；(5)在离心管中加入1.5mL胰蛋白酶和1.5mL脱氧核糖核酸酶，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液；(6)将细胞液依次用80、200、300目的细胞筛过滤；(7)将过滤后的细胞培养液离心去上清液，加入4～6mL的细胞培养液，吹打混匀，转到细胞培养皿中培养2小时后更换新的细胞培养液；(8)将培养皿中的细胞培养传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×10

【技术特征摘要】
1.一种提高种公猪精子活力激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)取出小公猪睾丸组织，放入加有1％双抗的37℃生理盐水中浸润10～30min；(2)取出浸润后的公猪睾丸组织，用含有1％双抗的PBS缓冲液清洗三遍；(3)加入DMEM/F12细胞培养液，37℃下培养30min，充分分解睾丸组织，将分散后的组织液转移至离心管中，离心去上清液；(4)在离心管中加入1.5mL透明质酸酶和1.5mL胶原酶IV，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液，离心去上清液；(5)在离心管中加入1.5mL胰蛋白酶和1.5mL脱氧核糖核酸酶，在37℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡2～3次后，加入3mL的DMEM/F12细胞培养液；(6)将细胞液依次用80、200、300目的细胞筛过滤；(7)将过滤后的细胞培养液离心去上清液，加入4～6mL的细胞培养液，吹打混匀，转到细胞培养皿中培养2小时后更换新的细胞培养液；(8)将培养皿中的细胞培养传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×106个细胞；(9)将细胞液培养8小时后取出，放到-20℃冷冻保存，即得。2.根据权利要求1所述的提高种...

【专利技术属性】
技术研发人员：董焕声，崔金强，潘庆杰，黄娇娇，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37