一种常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明专利技术所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播，提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

Application of Changshankong in the Preparation of Drugs for Preventing Foot and Mouth Disease Virus Infection

The invention relates to the application of Changshankong in the preparation of medicines for preventing foot-and-mouth disease virus infection, and belongs to the technical field of veterinary medicine. The application of the invention can further control the spread of foot-and-mouth disease and provide a class of highly effective, safe and controllable anti-foot-and-mouth disease virus drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用
本专利技术涉及兽用药物
，具体涉及一种常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
技术介绍
口蹄疫病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的口蹄疫，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。口蹄疫传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为A类动物疫病名单之首，我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位，同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前，疫苗免疫是防控口蹄疫的主要手段，然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此，为了弥补“免疫窗口期”，急需开发新型有效的抗病毒药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供常山酮(Halofuginone)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。本专利技术提供了常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。优选的是，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。优选的是，所述常山酮在所述药物中的浓度＞1μmol/L。本专利技术提供了常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。常山酮对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制。细胞试验显示，常山酮细胞毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制均具有抑制作用；进一步的实验证实，常山酮只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。常山酮能够作为一种有效的抗口蹄疫病毒成分。附图说明图1为本专利技术实施例1中不同浓度的Halofuginone对IBRS-2细胞的细胞毒性图；图2为本专利技术实施例1中不同浓度的Halofuginone对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；图3为本专利技术实施例1中不同浓度的Halofuginone对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；图4为本专利技术实施例1中不同浓度的Halofuginone对O型FMDV感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；图5为本专利技术实施例1中不同浓度的Halofuginone对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；图6为本专利技术实施例1中IFA检测不同浓度的Halofuginone对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；图7为本专利技术实施例1中q-PCR检测Halofuginone对FMDV吸附、穿入阶段中的mRNA抑制作用图；图8为本专利技术实施例1中Halofuginone在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；图9为本专利技术实施例1中Halofuginone在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。具体实施方式本专利技术提供了常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本专利技术中，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。常山酮对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，常山酮只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本专利技术对常山酮的来源没有特殊的限定，采用本领域的常规市售产品即可。在本专利技术中，所述常山酮在所述药物中的浓度＞1μmol/L。下面结合具体实施例对本专利技术所述的一种常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本专利技术的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例11.实验材料1.1细胞、病毒和药物IBRS-2细胞由本课题组保存；FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；Halofuginone购自MCE公司，以DMSO进行配制。1.2试剂DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；吐温-20购自上海生工生物工程公司；TritonX-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。2.实验方法和结果2.1Halofuginone在IBRS-2细胞上的毒性实验：采用MTS法测定Halofuginone对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Halofuginone100μL，以Halofuginone的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100％”计算出不同浓度的Halofuginone对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在80％以上，说明Halofuginone对IBRS-2细胞毒性极低。2.2Halofuginone在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Halofuginone100μL，以Halofuginone的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无Halofuginone、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养48h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100％”计算出不同浓度Halofuginone的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和WesternBlot分别检测FMDV2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremixExTaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.常山酮在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒包括A型...

【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，李世芳，龚美娇，邵军军，常艳燕，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62