鉴别表位的方法技术

本发明专利技术涉及鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法。本发明专利技术的方法通常包括蛋白质的限制性或约束性蛋白水解步骤以及蛋白质上被所用蛋白酶切割的位点的鉴别。本发明专利技术还涉及与已通过本发明专利技术方法鉴别的表位结合的抗体。

Methods for identifying epitopes

The present invention relates to a method for identifying epitopes on proteins that can be bound by antibodies. The method of the present invention usually includes restrictive or restrictive protein hydrolysis steps of proteins and identification of sites on proteins that are cleaved by proteases used. The invention also relates to antibodies that bind to epitopes identified by the method of the invention.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴别表位的方法
本专利技术涉及某些选择靶蛋白的表位的新方法，该方法用于但不限于抗体(例如功能性抗体)产生。因此，本专利技术在一些方面中涉及用于产生抗体的方法。此类方法典型地包括鉴别抗原表位和培育针对该抗原表位的抗体。本专利技术还涉及抗原表位和结合此类抗原表位的抗体。
技术介绍
由于用例如若干种单克隆抗体(mAb)疗法(包括阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)、赫赛汀(Herceptin))所见的临床成功，和例如靶向PCSK9的新型胆固醇下降mAb治疗(阿利库单抗(Alirocumab)和依伏库单抗(Evolocumab))的希望，抗体治疗的发展非常迅速。然而，目前市场上的所有抗体以及所有在晚期临床发展中的抗体通常是针对细胞外靶标，并且这些抗体通常是使用聚焦于亲和力或结合强度的筛选平台进行发现和开发。细胞内作用的抗体的开发和针对“困难靶标(即其中传统抗体发现方法失败的靶标)”的抗体的开发是一项艰巨的挑战，需要新的技术进步来发现和开发有效的抗体。对于细胞内作用的抗体，还需要用于将抗体内化至正确的靶器官中的细胞的新工具。此外，目前的抗体发现和开发平台通常缺乏(例如在医学症状中)可以预测具体抗体在给定生物系统中的工作的功能相关性、药理学相关性和作用机制相关性。今天，针对开发和发现成功抗体治疗的策略不限于完整大小的单克隆抗体。由于蛋白质工程的进步，在过去二十年中已经衍生出多种多样的工程化的抗体片段，这些片段包括Fab片段、ScFv片段、双抗体、四抗体，用蛋白质轭合物功能化的抗体片段、连同与两种抗原结合的双特异性片段。当尝试开发具有高特异性和亲和力、深层组织渗透性、高稳定性和低毒性的抗体和抗体衍生生物制剂时，这些新构建体提供了远远更大的工具箱。然而，抗体疗法的主要障碍之一仍然存在，并且该障碍是其对细胞外靶标的一般限制。抗体太大、太极性而不能通过细胞膜进入。此外，抗体通常在细胞溶质的还原环境中是不稳定的。已经开发了若干种技术来接近细胞内靶标，这些技术包括使用不同的转运载体(例如转染试剂和蛋白质转导结构域(PTD))跨细胞膜运输抗体，连同包括直接在靶细胞内表达抗体(所谓的胞内抗体)。尽管对抗体的应用不如小分子和遗传物质广泛，但是电穿孔技术也还是得到了应用。可以通过融合胞内抗体的遗传序列和细胞内运输信号来构建胞内抗体以靶向不同的细胞区室。对于有效递送载体的需要仍然是胞内抗体疗法中的关键步骤，因为仍然需要将编码胞内抗体的遗传物质递送至靶细胞。通过杂交瘤技术生产单克隆抗体首先在1975年开发出来。简言之，给哺乳动物注射感兴趣的抗原，这触发了哺乳动物的免疫应答。然后从动物脾取出脾细胞，并且稍后与永生骨髓瘤细胞进行融合。将细胞稀释至单个细胞并分离至多孔板中。由于一个细胞产生每个分离的群落，所以在单个孔中产生的抗体将是单克隆的。下一步是筛选所有不同的孔，以获得与抗原结合的最佳候选物。与完整大小的抗体相比，具有更小抗体片段的巨大优点是它们可以在不同的表达系统(例如，大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞)中生产，并且不再局限于用杂交瘤技术生产。这使得能够以更低的成本进行大规模生产，并且实现遗传调节抗体特性的许多可能性。抗体片段可以显示在丝状噬菌体的表面上，即所谓的噬菌体展示，丝状噬菌体可用于产生大的抗体文库，针对所需抗原对这些抗体文库进行筛选。筛选程序评估与抗原结合的抗体候选物。由于第一周期中的非特异性结合，筛选程序经常在若干个周期内重复。可以改变筛选周期期间的条件，以便在某些环境中找到最适合的候选物，例如可以通过使用恶劣环境来选择更稳定的抗体。选择具有非常高亲和力的抗体的另一种方法是用非常低浓度的抗原进行筛选，使得只保留那些能够在这种条件下结合的抗体。几家公司已经开发了他们自己的筛选技术，并且这几家公司通常具有大的抗体文库，例如再生元公司(Regeneron(regeneron.com))或Alligator生物技术公司(Alligatorbioscience(alligatorscience.se))。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：(i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和(ii)培育针对该抗原表位的抗体。在另一个方面，本专利技术提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：(i)通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中；和(iii)培育针对该抗原表位的抗体。在另一个方面，本专利技术提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：(i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和(ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中。本专利技术涉及检测和鉴别蛋白质中氨基酸序列的方法，其中所述氨基酸序列具有良好的暴露性并在功能上相关的，至少这些氨基酸序列是被很好地暴露的。因此，我们称之为“热点”的这些氨基酸序列可以用作引导抗体靶向、发现和开发的抗原表位。此外，这些氨基酸序列可以基于蛋白水解消化后的它们的出现、和基于来自已知的生物信息学数据或来自功能/药理学测试的功能相关性来进行排序。因此，从蛋白水解消化产生的若干个氨基酸序列的列表中，可以挑选最适合的氨基酸序列(基于功能和结构参数)用于抗原表位发现和开发。在限制性条件下进行蛋白水解消化，即蛋白酶或若干种蛋白酶的活性非常低，使得一次只有一个或几个表面暴露的肽从靶蛋白上切割掉。因此，蛋白酶用作针对结合靶蛋白的抗体的成药性探针。在一个实施例中，这些抗体是药理学活性的。在另一个实施例中，这些抗体是药理学活性的并且被开发用于治疗用途。更确切地，此类方法包括用于揭示靶蛋白的热点表位的蛋白质组学工具。在本专利技术的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且所有良好暴露本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：(i)用一种或多种蛋白酶执行所述蛋白质的计算机模拟蛋白酶消化，以鉴别蛋白质上被预测为被所述一种或者多种蛋白酶切割的位点；(ii)在体外用一种或多种蛋白酶进行所述蛋白质的限制性或约束性蛋白水解；(iii)通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质释放的肽，从而鉴别切割位点；(iv)将步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的切割位点与步骤(iii)中鉴别的切割位点进行比较；(v)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)中用一种或者多种抗体鉴别的切割位点；和(vi)鉴别所述一种或多种抗体是否与所述一种或多种表位结合，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上的表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.01 GB 1614884.31.一种鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：(i)用一种或多种蛋白酶执行所述蛋白质的计算机模拟蛋白酶消化，以鉴别蛋白质上被预测为被所述一种或者多种蛋白酶切割的位点；(ii)在体外用一种或多种蛋白酶进行所述蛋白质的限制性或约束性蛋白水解；(iii)通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质释放的肽，从而鉴别切割位点；(iv)将步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的切割位点与步骤(iii)中鉴别的切割位点进行比较；(v)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，但不是步骤(iii)中用一种或者多种抗体鉴别的切割位点；和(vi)鉴别所述一种或多种抗体是否与所述一种或多种表位结合，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上的表位。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括进行蛋白质同源建模以预测哪些计算机模拟预测的蛋白酶切割位点可能被暴露。3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括进行抗体片段或蛋白酶的计算机模拟对接以预测哪些计算机模拟预测的切割位点可能在体外被切割。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用单一蛋白酶。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用多种蛋白酶。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys-C、Lys-N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、中性白细胞弹性蛋白酶、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I和凝血酶。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Asp-N内肽酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白质。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白脂质体固定在流动池中以产生膜蛋白的固定相。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中通过步骤(ii)的体外蛋白酶消化鉴别从所述蛋白质中释放的肽，从而鉴别切割位点，通过质谱法进行。11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(v)之前生成一个或多个分离的表位的步骤，所述分离的表位具有对应于所述蛋白质上的一个或多个表位的序列，所述一个或多个表位位于含有或侧接切割位点的蛋白质区域中，所述切割位点是步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点，而不是步骤(iii)中鉴别的切割位点，和产生与所述分离的表位结合的抗体，和在步骤(v)中使用所述抗体探测所述蛋白质的所述一个或多个表位。12.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·奥尔瓦，C·特尔库利亚，M·戴维森，
申请(专利权)人：欧比力克治疗公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE