方法技术

本发明专利技术涉及在重组宿主细胞中制备新石房蛤毒素及其类似物和变体以及在生产新石房蛤毒素中的中间体的方法。新石房蛤毒素及其类似物和变体可用于生产药物组合物。

Method

The present invention relates to a method for preparing Neolithic clam toxin and its analogues and variants in recombinant host cells and intermediate in the production of Neolithic clam toxin. Neolithic meretrotoxin and its analogues and variants can be used in the production of pharmaceutical compositions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及新石房蛤毒素及其类似物的制备方法，以及在重组宿主细胞中产生新石房蛤毒素的中间体。新石房蛤毒素可以用于生产药物组合物。
技术介绍
电压门控钠通道(VGSC)是完整的膜蛋白，其形成离子通道，通过细胞质膜传导钠离子(Na+)。它们在动作电位的启动中起着重要作用。人们早就知道阻断这些通道可能有助于预防疼痛冲动的传递；现在已充分验证VGSC是用于治疗疼痛的靶标。特别地，目前正在镇痛药和麻醉剂的生产中研究许多VGSC拮抗剂。石房蛤毒素和新石房蛤毒素两者都作为VGSC的特异性阻断剂。因此，这些化合物在治疗疼痛中可能是有用的。石房蛤毒素(SXT)也称为麻痹性贝类毒素(PST)，是由许多蓝藻(例如鱼腥藻(Anabaena)、丝囊藻属(Aphanizomenon)、拟柱孢藻属(Cylindrospermopsis)、鞘丝藻属(Lyngbya)、浮丝藻属(Planktothrix)、尖头藻属(Raphidiopsis)、双歧藻属(Scytonema))和甲藻(亚历山大藻(Alexandrium)、裸甲藻(Gymnodinium)和梨甲藻(Pyrodinium))产生的神经毒素。石房蛤毒素是迄今已知的最致命的非蛋白质神经毒素之一，并可逆地结合VGSC以导致瘫痪。它导致许多人类食物中毒事件，因为摄入了受污染的滤食性水生动物(例如甲壳类动物、软体动物、贝类)，这些动物会对毒素进行生物累积。然而，存在许多SXT类似物包括新石房蛤毒素(它是SXT的N1-羟基化类似物)，虽然它们具有高特异性毒性，但当以低剂量施用时它们没有全身毒性。因此它们可能用作人类治疗剂。2015年6月，德国制药商Grunenthal与智利公司ProteusS.A.和美国波士顿儿童医院开展合作以开发使用新石房蛤毒素作为局部麻醉和术后疼痛管理的新型麻醉剂。还存在其它石房蛤毒素类似物的市场，例如膝钩藻毒素(gonyautoxin)，其已经临床测试为肌肉松弛剂。ProteusS.A.已经提交了与从天然产生新石房蛤毒素和石房蛤毒素的细胞(例如蓝藻细胞)生产和收获新石房蛤毒素和石房蛤毒素相关的专利申请(例如US2015/0099879)。Shimizu等首次提出了产生石房蛤毒素的生物合成途径(J.Am.Chem.Soc.(1984),106,6433–6434)。然而，直到2008年才首次鉴定石房蛤毒素(sxt)基因簇；这是在蓝藻拟柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)T3中(Kellmann等Appl.Environ.Microbiol.2008,74,4044–4053)。sxt基因簇由34个基因或开放阅读框(ORF)组成。基于Sxt蛋白的理论功能，这导致Kellmann等提出修订的(10步)用于产生石房蛤毒素的生物合成途径(参见本文的图1)。其它四个sxt基因簇已经在不同的属中被鉴定：卷曲鱼腥藻(Anabaenacircinalis)131C和丝囊藻属(Aphanizomenonsp.)NH-5(Mihali等BMCBiochem.10,8(2009))；鞘丝藻(Lyngbyawollei)(Mihali等PloSOne6,e14657(2011))；和尖头藻(Raphidiopsisbrookii)D9(Stucken,K.等PLoSONE5,e9235(2010))。然而值得注意的是，这些基因簇存在一些差异，包括缺少某些基因和其它基因重复。此外，sxt簇的结构在一些基因组中重新排列，导致石房蛤毒素类似物的生物合成。这使得用于产生石房蛤毒素和新石房蛤毒素的生物合成途径的阐明特别困难，因此通过重组途径防止石房蛤毒素和新石房蛤毒素的产生。在Kellmann(2008)提出的途径中，提出第一步涉及sxtA基因产物。sxtA基因编码与聚酮化合物合酶(PKS)相关的多结构域蛋白。Kellmann提出SxtA催化精氨酸和一个甲基化乙酸酯单元的缩合以产生4-氨基-3-氧代-胍基庚烷(AOGH)中间体。提出该方法以逐步进行，并由SxtA的四个结构域催化。据说乙酰转移酶结构域选择性地将乙酰辅酶A连接到全酰基载体蛋白的泛乙酰基臂上。据说由第一个SxA结构域催化的乙酰基部分的SAM依赖性甲基化导致丙酸盐的形成。据说AOGH生物合成的最后一步是丙酸盐与精氨酸的缩合，由II类氨基转移酶结构域催化。AOGH用作由sxt基因簇的其它成员编码的下游酶生物合成石房蛤毒素的底物。然而，由于缺乏化学标准，未确认AOGH的结构。尽管Tsuchiya及其同事最近已阐明AOGH的合成途径(Tsuchiya,S.等Org.Biomol.Chem.12,3016–3020(2014)；Tsuchiya,S.等Chem.Eur.J.21,7835–7840(2015))。该研究并没有研究SxtA或任何其它Sxt蛋白参与AOGH的生产。该步骤是石房蛤毒素和新石房蛤毒素生产中的关键步骤。因此，总之目前可用于制备石房蛤毒素和新石房蛤毒素的唯一商业上可获得的高产量途径是将其与天然产生它的细胞(例如蓝藻)分离。目前用于生产新石房蛤毒素的方法不能以制造所需药物组合物所需的量生产新石房蛤毒素。因此，存在对改进的生产新石房蛤毒素的方法的需要。现在已经足够详细地阐明了用于生产新石房蛤毒素的生物合成途径以便能够通过重组途径生产新石房蛤毒素。特别地，在Kellmann(2008)鉴定的34个sxt基因或ORF中，已经鉴定了用于生产新石房蛤毒素所必需的那些。现在已经发现，Kellmann(2008)提出的生物合成途径是不正确的，并且Kellmann途径是指一些对于重组生产新石房蛤毒素不必要的基因；Kellmann(2008)途径也未能提及一些生产新石房蛤毒素所必需的sxt基因。因此，本专利技术首次提供了用于生产新石房蛤毒素及其类似物的重组途径，以及用于在新石房蛤毒素及其类似物的生产中生产各种中间体的重组途径。本专利技术还有助于生产石房蛤毒素及其其它类似物，例如膝钩藻毒素。
技术实现思路
在一种实施方式中，本专利技术提供了用于生产新石房蛤毒素或其类似物的方法，该方法包括以下步骤：(A)在反应介质中将以下底物与SxtA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X多肽接触：(i)S-腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸，(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯以及任选地(B)从反应介质中分离和/或纯化新石房蛤毒素或其类似物。优选地，该方法在宿主细胞中进行，所述宿主细胞包含编码所述Sxt多肽的核酸分子。本专利技术还提供了在宿主细胞中生产石房蛤毒素或其类似物的方法，该方法包括以下步骤：(A)在以下底物的存在下，在培养基中培养包含编码Sxt多肽A、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X的核酸分子的宿主细胞：(i)S-腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸，(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯优选在适合生产新石房蛤毒素或其类似物的条件下。优选地，宿主细胞另外包含编码PPT酶的核酸分子。优选地，该方法还包括从宿主细胞或培养基中分离和/或纯化新石房蛤毒素或其类似物的步骤。如本文所用，术语“新石房蛤毒素”是指具有以下结构的化合物或其立体异构体：宿主细胞可以是能够表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在宿主细胞中生产新石房蛤毒素的方法，该方法包括以下步骤：(A)在适合生产新石房蛤毒素的条件下，在以下底物存在下在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码PPT酶和编码Sxt多肽A、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X的核酸分子：(i)S‑腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯，并且其中，所述宿主细胞不包含编码Sxt多肽C、F、J、K、L、M、P、Q、R和ORF24的核酸分子；以及任选地(B)从所述宿主细胞或所述培养基中分离和/或纯化新石房蛤毒素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.12 GB 1602576.91.一种在宿主细胞中生产新石房蛤毒素的方法，该方法包括以下步骤：(A)在适合生产新石房蛤毒素的条件下，在以下底物存在下在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码PPT酶和编码Sxt多肽A、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X的核酸分子：(i)S-腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯，并且其中，所述宿主细胞不包含编码Sxt多肽C、F、J、K、L、M、P、Q、R和ORF24的核酸分子；以及任选地(B)从所述宿主细胞或所述培养基中分离和/或纯化新石房蛤毒素。2.一种生产新石房蛤毒素或其类似物或变体的方法，该方法包括以下步骤：(A)在反应介质中将以下底物与SxtA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X多肽接触：(i)S-腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯，以及任选地(B)从所述反应介质中分离和/或纯化新石房蛤毒素或其类似物或变体。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述反应介质另外包含PPT酶。4.一种在宿主细胞中生产新石房蛤毒素或其类似物或变体的方法，该方法包括以下步骤：(A)在适合生产新石房蛤毒素或其类似物或变体的条件下，在以下底物存在下在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码Sxt多肽A、B、D、G、H、I、S、T、U、V、W和X的核酸分子：(i)S-腺苷甲硫氨酸，(ii)精氨酸(iii)乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或丙酰辅酶A，和(iv)氨基甲酰磷酸酯；以及任选地(B)从所述宿主细胞或所述培养基中分离和/或纯化新石房蛤毒素或其类似物或变体。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述宿主细胞另外包含编码PPT酶的核酸分子。6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述底物不与Sxt多肽C、J和K中的一种或多种或所有接触，和/或所述宿主细胞不包含编码Sxt多肽C、J和K中的一种或多种或所有的核酸分子。7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中，所述底物不与Sxt多肽Q、R和ORF24中的一种或多种或所有接触，和/或所述宿主细胞不包含编码Sxt多肽Q、R和ORF24中的一种或多种或所有的核酸分子。8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中，所述底物不与(a)-(c)中的一个或多个中的任何Sxt多肽接触：(a)C、Q、R和ORF24；(b)L、Q、R和ORF24；或(c)J、K、L、Q、R和ORF24；和/或所述宿主细胞不包含编码(a)-(c)中的一个或多个中的任何所述Sxt多肽的核酸分子。9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中，所述底物不与Sxt多肽F、M和P中的一种或多种或所有接触，和/或所述宿主细胞不包含编码Sxt多肽F、M和P中的一种或多种或所有的核酸分子。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·科尔曼，B·尼兰，
申请(专利权)人：卑尔根技术交易股份公司，澳大利亚新南创新有限公司，
类型：发明
国别省市：挪威,NO