使用RNA分子控制鞘翅目有害生物制造技术

本文披露了对鞘翅目昆虫具有毒性的双链RNA分子。具体地，本文提供了能够干扰有害生物靶基因并对靶有害生物具有毒性的干扰RNA分子。此外，本文披露了例如在转基因植物中制备并使用该干扰RNA或制备并使用该干扰RNA作为组合物中的活性成分以赋予免受昆虫损害的保护的方法。

Control of Coleoptera Pests by RNA Molecules

The double-stranded RNA molecule that is toxic to Coleoptera insects is disclosed in this paper. Specifically, we provide RNA molecules that can interfere with target genes of pests and are toxic to target pests. In addition, methods for preparing and using the interfering RNA, for example in genetically modified plants, or for preparing and using the interfering RNA as an active component in compositions to provide protection against insect damage are disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用RNA分子控制鞘翅目有害生物序列表提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.821提交的，名称为“81018_ST25.txt”，大小为548千字节，于2017年6月27日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。
本专利技术总体上涉及由其摄食活动而引起对作物植物损害的有害生物的控制，并且更具体地涉及通过包含干扰RNA分子的组合物控制鞘翅目有害生物。本专利技术进一步涉及包含干扰RNA分子的组合物并且涉及使用此类组合物的方法。
技术介绍
根萤叶甲属(Diabrotica)中的昆虫种类(玉米根虫和黄瓜叶甲)被认为是对作物植物最重要的有害生物中的一些。例如，玉米根虫的种类，包括西方玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera)，西方玉米根虫(WCR)，巴氏根萤叶甲(D.barberi)，北方玉米根虫(NCR)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctatahowardi)，南方玉米根虫(SCR)及墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgiferazeae)，墨西哥玉米根虫(MCR)，是北美最具破坏性的玉米有害生物，每年导致估计超过十亿美元的损失。西方玉米根虫也已经入侵欧洲并且每年导致估计五亿欧元损失。南美叶甲(除了别的之外，俗名包括叶甲、巴西小甲虫、葫芦甲虫及菊花甲虫)在南美是一种重要的玉米、大豆及花生有害生物。玉米损失的大部分由根虫幼虫摄食导致。刚孵出的根虫幼虫位于土壤中的玉米根部并且最初开始摄食细根毛并钻入玉米植物的根尖中。随着幼虫长大，它们摄食初生根并挖隧道进入其中。当根虫数量巨大时，幼虫摄食和由根腐病病原体导致的受损根的劣变可以导致根减少至茎的基部。严重的根损伤干扰根将水和营养素运输进植物的能力，减少植物生长，并且导致谷物产量减少。严重的根损伤还可以导致玉米植物的倒伏，使得机械收获更困难或不可能。玉米根虫成虫主要摄食玉米须、花粉以及暴露的穗尖上的籽粒。如果玉米根虫成虫在玉米生殖组织存在之前开始出现，则成虫可以摄食叶组织，刮掉绿色的表面组织并且留下窗玻璃外观。成虫摄食穗丝可以导致穗尖处的穗丝减少，通常称作穗丝修剪(silkclipping)。在大田玉米中，甲虫种群在花粉散发过程中可以达到足以导致严重的穗丝修剪的程度，这可以干扰授粉并减少收率。因此，不像仅幼虫期导致损失的玉米的鳞翅目有害生物，玉米根虫的幼虫期和成虫期都能够对玉米导致经济损失。根萤叶甲属昆虫有害生物主要是通过密集应用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖或导致死亡而可以有效对抗幼虫期和成虫期。由此可以达到良好的昆虫控制，但这些化学品有时也会影响其他益虫。另外的问题出现在使用高杀昆虫剂的区域中，在这些区域中玉米根虫甲虫种群对某些杀昆虫剂已经变得有抗性。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但对于可替代的有害生物控制试剂存在着越来越多的需要。来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或Cry3Ab(eCry3.1Ab)蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。种子产业、大学研究员以及美国环境保护局已经一起合作来制定管理计划，以帮助缓解昆虫对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的发生。它们主要是基于高剂量以及避护所策略。针对玉米的高剂量策略是使用表达甚至足够杀死部分抗性昆虫的高水平的杀昆虫蛋白(例如Cry蛋白)的玉米杂交种。基础的假设是杀死部分抗性的昆虫并且大力防止它们交配，从而延迟了抗性的产生。高剂量策略的成功部分取决于杀昆虫蛋白对具体昆虫种类的特异性活性以及多少该杀昆虫蛋白可以被表达于转基因玉米植物中。杀昆虫蛋白对有害生物的特异性活性越高，需要表达于转基因植物中以实现高剂量策略的杀昆虫蛋白的量越少。例如，表达鳞翅目-有效Cry蛋白(Cry1Ab)的玉米杂交种被认为对抗主要靶有害生物欧洲玉米螟(玉米螟)是高剂量的。由于Cry1Ab以LC50<10ng/cm2对于欧洲玉米螟幼虫很具毒性(即，高特异性活性)，在转基因植物中可实现的Cry1Ab表达水平很容易将这样的玉米杂交种置于高剂量范畴中。然而，不像鳞翅目-有效产品，当前根虫产品不被认为是高剂量的。它们表达的蛋白不有效对抗成虫并且对晚龄幼虫具有有限活性。因此，当前转基因根虫产品允许一些根虫幼虫存活并成为成虫。因此，由玉米根虫成虫导致的穗丝修剪的经济水平仍可以甚至出现在种植为转基因玉米根虫杂交种的部分大田中。例如，西方玉米根虫成虫的密度可以在种植为转基因玉米根虫杂交种的部分大田中超过经济水平，这归因于甲虫的迁入以及成虫从转基因根系的直接羽化。已经有许多报道确认西方玉米根虫成虫羽化自某些玉米转基因根虫杂交种(Crowder等人2005.J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]98:534-551)。另一个出版物表明，当在大田中遇到一些转基因玉米植物或非转基因玉米植物时，西方玉米根虫成虫将展现出类似的摄食行为，并且表明转基因植物中的某些杀昆虫蛋白对可能影响抗性管理的成虫将具有显著效果是不太可能的。因此，鉴定具有新作用模式的可替代的昆虫控制试剂将是有益的。特别有用的将可以是对靶昆虫有害生物的多个生活期具有毒性的新昆虫控制试剂。此类昆虫控制试剂可以包括靶向遗传因子(例如对于靶昆虫有害生物的生长和存活必不可少的基因)的那些昆虫控制试剂。当一种生物体识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所产生的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段称作小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于该复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，该此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。大部分植物微小RNA(miRNA)对其靶mRNA显示出广泛的碱基配对，并引导其裂解(Jones-Rhoades等人(2006)Annu.Rev.PlantBiol.[植物生物学年评]57,19-53；Llave等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97,13401-13406)。在其他例子中，干扰RNA可以结合至具有非完美互补性的靶RNA分子，导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。到目前为止，多数研究的动物miRNA似乎以此方式发挥功能。已发现RNAi可用于对某些昆虫有害生物的昆虫控制。RNAi策略典型地使用合成的、非天然存在的“干扰RNA”或“干扰RNA分子”，其典型地至少包含针对靶基因的RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干扰核糖核酸(RNA)分子，其中该RNA包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域，其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列，该序列与在根萤叶甲属(Diabrotica spp)靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的，并且(i)至少与SEQ ID NO:121‑210，SEQ ID NO:274‑276，SEQ ID NO:280‑282，SEQ ID NO:298‑312，SEQ ID NO:345‑371，SEQ ID NO:373、374、378、380、389‑396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少85％同一性；(ii)至少包含SEQ ID NO:121‑210，SEQ ID NO:274‑276，SEQ ID NO:280‑282，SEQ ID NO:298‑312，SEQ ID NO:345‑371，SEQ ID NO:373、374、378、380、389‑396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121‑210，SEQ ID NO:274‑276，SEQ ID NO:280‑282，SEQ ID NO:298‑312，SEQ ID NO:345‑371，SEQ ID NO:373、374、378、380、389‑396、399、400编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交，该组由以下组成：SEQ ID NO:121‑210，SEQ ID NO:274‑276，SEQ ID NO:280‑282，SEQ ID NO:298‑312，SEQ ID NO:345‑371，SEQ ID NO:373、374、378、380、389‑396、399、400，及其互补序列，其中该干扰RNA分子对鞘翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.05 US 62/371,2591.一种干扰核糖核酸(RNA)分子，其中该RNA包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域，其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列，该序列与在根萤叶甲属(Diabroticaspp)靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的，并且(i)至少与SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少85％同一性；(ii)至少包含SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)至少包含编码由SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交，该组由以下组成：SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400，及其互补序列，其中该干扰RNA分子对鞘翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。2.如权利要求1所述的干扰RNA分子，其中所述鞘翅目植物有害生物是根萤叶甲属昆虫。3.如权利要求1所述的干扰RNA分子，其中该RNA包含至少两种dsRNA，其中每种dsRNA包含核苷酸的序列，该序列与该靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的。4.如权利要求3所述的干扰RNA分子，其中所述dsRNA中的每种包含不同的核苷酸序列，该序列与该靶基因中的不同靶核苷酸序列是至少部分互补的。5.如权利要求1所述的干扰RNA分子，其中该干扰RNA分子包含SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400，或其互补序列。6.如权利要求1所述的干扰RNA分子，其中该dsRNA是含有基本上互补的退火链的双链RNA的区域。7.如权利要求1所述的干扰RNA分子，其中该dsRNA是含有完全互补的退火链的双链RNA的区域。8.如权利要求1至7中任一项所述的干扰RNA分子，其中该根萤叶甲属昆虫选自下组，该组由以下组成：巴氏根萤叶甲(D.barberi)、西方玉米根萤叶甲(D.virgifera)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata)、斯格尼根萤叶甲(D.significata)以及南美叶甲(D.speciosa)。9.一种核酸构建体，其包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。10.一种核酸分子，其编码如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。11.一种核酸构建体，其包含编码如权利要求10所述的核酸分子的核苷酸序列。12.如权利要求9或11中任一项所述的核酸构建体，其中该核酸构建体是表达载体。13.一种重组载体，其包含可操作地连接至如下核苷酸序列的调节序列，该核苷酸序列编码如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。14.一种组合物，其包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子中的两种或更多种。15.如权利要求14所述的组合物，其中该两种或更多种干扰RNA分子存在于相同的核酸构建体上、不同的核酸构建体上或其任何组合上。16.如权利要求14或15中任一项所述的组合物，该组合物包含含有至少一种dsRNA的干扰RNA分子，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域，其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列，该序列(i)至少与SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少85％同一性；或者(ii)至少包含SEQIDNO:121-210，SEQIDNO:274-276，SEQIDNO:280-282，SEQIDNO:298-312，SEQIDNO:345-371，SEQIDNO:373、374、378、380、389-396、399、400的19个连续核苷酸的片段，或其互补序列。17.一种组合物，其包含如权利要求9、11或12中任一项所述的核酸构建体中的两种或更多种，其中该两种或更多种核酸构建体各自包含不同的干扰RNA。18.一种组合物，其包含如权利要求10所述的核酸分子中的两种或更多种，其中该两种或更多种核酸分子各自编码不同的干扰RNA分子。19.一种用于抑制根萤叶甲属昆虫靶基因表达的杀昆虫组合物，该组合物包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA，以及农业上可接受的载体。20.如权利要求19所述的杀昆虫组合物，其至少包含用于控制根萤叶甲属昆虫的第二杀昆虫剂。21.如权利要求20所述的杀昆虫组合物，其中该第二杀昆虫剂是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)杀昆虫蛋白。22.如权利要求20所述的杀昆虫组合物，其中该第二杀昆虫剂不是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。23.如权利要求20所述的杀昆虫组合物，其中该第二杀昆虫剂是马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。24.如权利要求22所述的杀昆虫组合物，其中该第二杀昆虫剂是或源自蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)杀昆虫蛋白、致病杆菌属(Xenorhabdusspp.)杀昆虫蛋白、光杆菌属(Photorhabdusspp.)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporous)杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillussphearicus)杀昆虫蛋白、色杆菌属(Chromobacteriumspp.)杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌(Yersiniaentomophaga)杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌(Paenibacilluspopiliae)杀昆虫蛋白、或梭菌属(Clostridiumspp.)杀昆虫蛋白。25.一种转基因植物或其部分，包含如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA分子、核酸分子、核酸构建体和/或组合物，其中当与对照植物相比时，该转基因植物对根萤叶甲属昆虫具有增强的抗性。26.如权利要求25所述的转基因植物或其部分，其中该转基因植物至少包含用于控制根萤叶甲属昆虫的第二杀昆虫剂。27.如权利要求26所述的转基因植物或其部分，其中该第二杀昆虫剂是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。28.如权利要求26所述的转基因植物或其部分，其中该第二杀昆虫剂不是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。29.如权利要求26所述的转基因植物或其部分，其中该第二杀昆虫剂是马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。30.如权利要求28所述的转基因植物或其部分，其中该第二杀昆虫剂是或源自蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白。31.如权利要求25至30中任一项所述的转基因植物或其部分，其中该转基因植物或其部分是玉蜀黍植物或其部分。32.一种转基因种子，其是如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物的转基因种子。33.一种生物样品，其来自如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物或其部分。34.一种商品产品，其源自如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物或其部分。35.如权利要求34所述的商品产品，其中该商品产品选自下组，该组由以下各项组成：整个或经处理的种子、豆类、谷物、籽粒、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、糖、淀粉、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、蜡、油、提取物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料、纤维、纸或者其他从植物生产的食物或产品。36.一种控制根萤叶甲属昆虫的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为如权利要求1-8所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1-8所述的干扰RNA分子的核酸分子接触，该干扰RNA分子用于抑制靶基因在根萤叶甲属昆虫中的表达，从而控制该根萤叶甲属昆虫。37.如权利要求36所述的方法，其中该靶基因包含如下编码序列，该编码序列：a)至少与SEQIDNO:1-30，SEQIDNO:91-120，SEQIDNO:271-273，SEQIDNO:277-279，SEQIDNO:283-297，SEQIDNO:313-317，SEQIDNO:372、377、379，SEQIDNO:381-388，SEQIDNO:399；或SEQIDNO:400的19个核苷酸的连续片段具有至少85％同一性；b)至少包含SEQIDNO:1-30，SEQIDNO:91-120，SEQIDNO:271-273，SEQIDNO:277-279，SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·V·多诺霍，Y·瑙德特，P·菲尔德曼，L·德拉格夫，I·马莱特，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH