提供用作强效活疫苗的稳定脱水的原生动物的冻干方法技术

公开了一种用于冻干新孢子虫和其他原生动物的改进的起稳定作用的缓冲液。还公开了一种改进的冻干方法，所述方法包括在冷冻步骤期间控制冰核形成。

Provide freeze-drying methods for stable dehydration of protozoa used as a potent live vaccine

A stabilized buffer for lyophilization of neosporidium and other protozoan improvements is disclosed. An improved freeze-drying method is also disclosed, which includes controlling ice nucleation formation during the freezing step.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提供用作强效活疫苗的稳定脱水的原生动物的冻干方法
本专利技术特别涉及冻干犬新孢子虫(Neosporacaninum)和保持其活力的方法。本专利技术还适用于一般用于维持冻干原生动物的活力、免疫原性以及感染性的改进的保存(稳定化)方法。
技术介绍
犬新孢子虫是一种专性、细胞内、球虫、原生动物寄生虫。新孢子虫的分类学分类如下：门：顶复门(Apicomplexa)；纲：球虫纲(Coccidia)；目：真球虫目(Eucoccidiorida)；科：肉孢子虫科(Sarcocystidae)；属：新孢子虫属。顶复门基于表型特征含有几个明确定义的群体，包括：球虫(新孢子虫；弓形虫(Toxoplasma)；哈蒙德虫(Hammondia)；隐孢子虫(Cryptosporidium))；簇虫(gregarine)(例如兰克氏原虫(Lankesteria))以及血孢子虫(haemospridian)(例如疟原虫(Plasmodiu)；梨浆虫(piroplasm)(例如泰累尔梨浆虫(Theileria))。犬新孢子虫能够感染家养和野生的犬科动物以及反刍动物。在犬科动物中，新孢子虫病表现为神经肌肉疾病。在20世纪80年代中期的挪威，狗的犬新孢子虫感染导致了广泛报告的神经肌肉变性病例，这会引起后肢麻痹。在肉牛和奶牛这两者中新孢子虫病是一种经济成本高昂的疾病，并且是牛流产的最常诊断的病因。另一种新孢子虫属物种洪氏新孢子虫(Neosporahughesi)可以感染马，并且与胎儿脑脊髓炎有关(Pusterla等,J.Parasitol.,97:281-5；2011)。在1988年之前，犬新孢子虫被错误分类为刚地弓形虫(Toxoplamagondii)，这是因为这两者之间具有结构相似性(Dubey,IntJParasitol.29(10):1485-8；1999)。这两个物种都是组织寄生性球虫并且共有许多共同的生物学和形态特征。然而，甚至是最初将犬新孢子虫识别为一种物种都受到了质疑，这是因为它与海氏哈蒙德虫(Hammondiaheydorni)共有极端相似性(Dubey等,TrendsParasitol.,18:66-9；2002)。虽然这两种生物体之间存在遗传差异，但是它们在物理上是非常相似的；并且海氏哈蒙德虫的卵囊在形态上与犬新孢子虫的卵囊无法区分(McAllister等,JParasitol.,28:1473-9；1998)。犬新孢子虫的生命周期包括在犬科动物(终)宿主中的有性复制和在诸如牛的中间宿主中的无性复制。在终宿主的粪便中通过的卵囊可以被牛摄入，之后运动型速殖子被释放，其进而扩散到受感染的牛的整个组织中。速殖子进而发展成缓殖子形式，其在肌肉中形成孢囊。犬科动物通过食用受污染的肉类而受到感染，并且在它们自己的粪便中排出卵囊。卵囊基本上是厚壁孢子，并且它们主要由蛋白质(67％-90％)组成的稳固的壁允许它们在宿主外长时间存活。然而，卵囊壁虽然能抵抗机械和化学损伤，但是易受冷冻和解冻的影响。在某种程度上，这归因于在冷冻和解冻期间发生的刚性卵囊壁的膨胀和收缩的有害影响。然而，速殖子是快速分裂的、运动的并且在它们的膜结构上比卵囊更具流动性。(Belli等,TrendsParasitol.,22(9):416-23,2006；Mai等,Mem.Inst.OswaldoCruz,104(2):281-9,2009；Goodswen等,Infection,Genetics,Evolution,13:133-50,2013)。然而，即使是使用速殖子，破坏作用也可能由于细胞内和细胞外冰晶的形成而发生。这必须被减到最低限度和控制，特别是在冻干过程期间。本专利技术的冻干和稳定化程序一般适用于顶复门原生动物的所有生命周期阶段。冻干(冷冻干燥)是在制备脱水产品中去除水的常用技术。一般来说，冻干包括三个步骤：(1)将含水组合物在低温下冷冻；(2)通过在减压和低温的条件下升华来去除大部分水；以及(3)通过在减压和更高温度的条件下解吸进一步去除残留的键合水。冷冻干燥的产品含有非常低的残留水(约0.5％w/w-5.0％w/w)，并且干燥材料呈无定形形式。在使用之前，必须将干燥的产品再水化。在上述步骤中的任一个步骤期间可能发生对冷冻干燥产品的损伤，包括活力丧失、免疫原性降低以及感染性受损/消除。因此，在对组合物进行冻干之前常常将起稳定作用的成分(冷冻保护剂/冻干保护剂)和缓冲剂添加到所述组合物中，并且必须精确地限定每一个步骤，特别是再水化步骤的量级和动力学(Mille等,BiotechBioeng.83,578；2003)。包含生物成分，包括诸如新孢子虫的原生动物的免疫原性组合物对它们的制备、配制以及储存条件是非常敏感的。在其中用犬新孢子虫速殖子对牛进行免疫接种的研究中，证实了如果将速殖子在-80C在DMSO中冷冻，那么相比于没有冷冻的速殖子，保护作用减少(Weber等；ClinVaccineImmunol.,20(1):99-105,2013)。虽然已经测试了大量化合物使含有活减毒生物成分的不同组合物稳定的能力，但是仍然需要新的保存溶液以及改进的冷冻干燥方法，用于保持原生动物的活力、免疫原性以及感染性，包括新孢子虫和所有上述顶复门。
技术实现思路
本专利技术的申请人已经惊人地鉴定出并且在本文公开了更有效的起稳定作用的制剂以及用于冻干原生动物(包括新孢子虫)的改进的方法。本专利技术的一个实施方案提供了一种冻干原生动物的方法，其中所述方法包括使用起稳定作用的缓冲液，所述起稳定作用的缓冲液包含选自由以下组成的组的组分：牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80以及胎牛血清。另一个实施方案提供了前一个实施方案的缓冲液包含牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80以及胎牛血清。另一个实施方案提供了前述实施方案的缓冲液还包含：海藻糖；柠檬酸；以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，其也可以用抗坏血酸代替(对于本专利技术的所有实施方案)。另一个实施方案提供了一种冻干原生动物的方法，其中所述方法包括在冷冻步骤期间通过用惰性气体或空气加压和减压来控制冰核形成。另一个实施方案提供了在前一个实施方案的方法期间，通过用惰性气体加压和减压来控制冰核形成。另一个实施方案提供了所述惰性气体是氮气或氩气。另一个实施方案提供了所述冻干方法包括以下步骤：A.将细胞、原生动物以及起稳定作用的缓冲液的混合物加入处于约5℃和约1巴的干燥室中；B.将所述腔室的温度降低到-1℃至-15℃，并且保持约5分钟；C.将所述腔室加压到1.2巴至2巴，并且保持约45分钟，同时将所述腔室的温度维持在-1℃至-15℃；D.将所述腔室快速减压到约1巴，同时将温度保持在-1℃至-15℃；E.将所述腔室中的压力保持在约1巴，将温度降低到低至-50℃，并且保持约45分钟；F.将所述腔室中的压力保持在约1巴，将温度保持在低至-50℃，再持续约90分钟；G.将所述腔室中的温度保持在低至-50℃，将腔室压力降低到约0.1毫巴，并且保持约30分钟；H.将所述腔室中的温度保持在低至-50℃，将腔室压力降低到约0.01毫巴，并且保持约60分钟；I.将所述腔室中的压力保持在约0.01毫巴，将所述腔室中的温度升高到高达-35℃，并且保持约60分钟；J.将所述腔室中的压力保持在约0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将原生动物冻干的方法，其中所述方法包括使用起稳定作用的缓冲液，所述起稳定作用的缓冲液包含选自由以下组成的组的组分：牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80以及胎牛血清。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.05 US 62/404,4481.一种将原生动物冻干的方法，其中所述方法包括使用起稳定作用的缓冲液，所述起稳定作用的缓冲液包含选自由以下组成的组的组分：牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80以及胎牛血清。2.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液包含牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80以及胎牛血清。3.如权利要求2所述的方法，其中所述缓冲液还包含海藻糖、柠檬酸以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。4.一种将原生动物冻干的方法，其中所述方法包括在冷冻步骤期间，通过用惰性气体或空气加压和减压来控制冰核形成。5.如权利要求4所述的方法，其中通过用惰性气体加压和减压来控制冰核形成。6.如权利要求5所述的方法，其中所述惰性气体是氮气或氩气。7.如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：A.将细胞、原生动物以及起稳定作用的缓冲液的混合物加入处于约5℃和约1巴的干燥室中；B.将所述腔室的温度降低到-1℃至-15℃，并且保持约5分钟；C.将所述腔室加压到1.2巴至2巴，并且保持约45分钟，同时将所述腔室的温度维持在-1℃至-15℃；D.将所述腔室快速减压到约1巴，同时将所述温度保持在-1℃至-15℃；E.将所述腔室中的所述压力保持在约1巴，将所述温度降低到低至-50℃，并且保持约45分钟；F.将所述腔室中的所述压力保持在约1巴，将所述温度保持在低至-50℃，再持续约90分钟；G.将所述腔室中的所述温度保持在低至-50℃，将所述腔室压力降低到约0.1毫巴，并且保持约30分钟；H.将所述腔室中的所述温度保持在低至-50℃，将所述腔室压力降低到约0.01毫巴，并且保持约60分钟；I.将所述腔室中的所述压力保持在约0.01毫巴，将所述腔室中的所述温度升高到高达-35℃，并且保持约60分钟；J.将所述腔室中的所述压力保持...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·道尤斯，F·H·韦伯，
申请(专利权)人：硕腾服务有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US