一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。本发明专利技术首先保护一种sgRNA，命名为G12S‑sgRNA，其靶序列长度为15‑25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20‑34位核苷酸。本发明专利技术还保护一种用于治疗癌症的药物，其活性成分为所述sgRNA。本发明专利技术还保护所述sgRNA在制备药物中的应用；所述药物为治疗癌症的药物。本发明专利技术提供的G12S‑sgRNA适用于对携带G12S突变型KRAS基因的恶性肿瘤的精准靶向治疗，具有很强的应用前景和临床应用价值。

A CRISPR-based technique for the treatment of KRAS mutant malignant tumors with sgRNA and its application

The invention discloses a sgRNA based on RISPR technology for treating KRAS mutant malignant tumors and its application. The present invention first protects a sgRNA, named G12S sgRNA, with a target sequence length of 15 25 BP and a 20 34 nucleotide in sequence 2. The invention also protects a drug for treating cancer, the active ingredient of which is the sgRNA. The invention also protects the application of the sgRNA in the preparation of drugs, which are drugs for cancer treatment. The G12S sgRNA provided by the invention is suitable for precise targeting therapy of malignant tumors carrying G12S mutant KRAS gene, and has strong application prospect and clinical application value.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用
本专利技术涉及一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPRassociated)基因编辑系统是第三代基因编辑技术。对比前两代基因编辑技术ZFN和TALEN，CRISPR有更高的切割效率，更易用的系统基因以及高自由度的靶位点选择空间，其应用更加广泛和大众化。CRISPR/Cas9主要有三部分组成，用于靶向识别的5’端含有20nt左右引导序列的crRNA(CRISPR-derivedRNA)与其3’部分互补配对的tracrRNA(trans-activatingRNA)以及Cas9核酸酶。crRNA和tracrRNA主要通过核酸互补配对起到DNA的靶向识别功能，而cas9则作为解旋酶和核酸酶辅助识别、完成DNA定点切割。其中，Cas9的Ruvc和HNH元件分别对非互补链和互补链进行剪切，在特定位置造成DNA双链断裂。随着技术的发展，在不影响系统效率的情况下，本领域技术人员将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA，即sgRNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。本专利技术首先保护一种sgRNA，命名为G12S-sgRNA，其靶序列长度为15-25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20-34位核苷酸。所述靶序列为序列2中的第n1-n2位核苷酸；n1为10以上的自然数，n2为44以下的自然数。所述靶序列为序列2中的第16-35位核苷酸。G12S-sgRNA具体如序列表的序列3所示。本专利技术还保护编码所述sgRNA的DNA分子。本专利技术还保护具有所述DNA分子的重组载体。所述重组载体中还具有编码Cas蛋白的基因。所述Cas蛋白具体可为Cas9蛋白。所述重组载体的制备方法具体可为：分别合成KRAS-G12S-gRMA-F和KRAS-G12S-gRMA-R，然后退火，将退火得到的具有粘末端的双链DNA分子与具有粘末端的载体骨架连接，得到重组质粒-tsG12S。具有粘末端的载体骨架是用限制性内切酶BsmBI酶切LentiCRISPRV2载体得到的。本专利技术还保护一种药物，其活性成分为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述癌症由特定癌细胞引起，所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。本专利技术还保护以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述癌症由特定癌细胞引起；所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。本专利技术还保护一种用于对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑的产品，其活性成分为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。本专利技术还保护以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体在制备产品中的应用；所述产品的功能为对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑。本专利技术还保护用于特异沉默G12S突变型KRAS基因的物质在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述“特异沉默G12S突变型KRAS基因”指的是沉默“G12S突变型KRAS基因”且不沉默“野生型KRAS基因”。所述用于特异沉默G12S突变型KRAS基因的物质具体可为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。所述癌症由特定癌细胞引起；所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。以上任一所述G12S突变型KRAS基因如序列表的序列2所示。以上任一所述野生型KRAS基因如序列表的序列1所示。本专利技术基于CRISPR技术开发一种针对KRAS-G12位点点突变的sgRNA，实现了高特异性和高效的G12S突变型KRAS基因的靶向，可以高效特异地杀伤携带G12S突变型KRAS基因的肿瘤细胞，对野生型KRAS基因没有编辑作用，因此仅抑制携带KRAS突变基因的细胞的增殖，对携带野生型KRAS基因的正常细胞没有影响。在世界范围内，KRAS基因突变在肿瘤患者中的携带率非常高，如KRAS基因突变在肺癌中的发生率为15-25％，其中G12S突变率为5％。而在非小细胞肺癌中，KRAS基因突变的发生率更是超过1/4。在结直肠癌中，36-40％的肿瘤患者携带KRAS基因突变，其中G12S突变率占4.9-5.7％。目前尚无有效的临床用KRAS靶向的小分子药物。本专利技术提供的G12S-sgRNA适用于对携带G12S突变型KRAS基因的恶性肿瘤的精准靶向治疗，具有很强的应用前景和临床应用价值。附图说明图1为实施例2的步骤二中T7E1酶切的结果。图2为实施例2的步骤三中T7E1酶切的结果。图3为实施例2的步骤三中测序的结果。图4为实施例2的步骤四的结果。图5为实施例2的步骤五的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的DNA序列均为5’→3’方向。LentiCRISPRV2载体：Addgene,产品编号#52961。293T细胞(人胚胎肾细胞)，携带野生型KRAS基因：中国科学院细胞库，货号SCSP-502。A549细胞(人肺腺癌细胞)，携带G12S突变型KRAS基因：COBIOER，货号CBP60084，品牌)。H2228细胞(人非小细胞肺癌细胞)，携带野生型KRAS基因：COBIOER，货号CBP60073。野生型KRAS基因如序列表的序列1所示。G12S突变型KRAS基因如序列表的序列2所示。实施例1、sgRNA的设计经过大量序列比对、设计、效果验证和比较，从设计的sgRNA中选择一条靶向G12S突变型KRAS基因的效果最好的sgRNA，命名为G12S-sgRNA。设置针对野生型KRAS基因相应位点的sgRNA，命名为WT-sgRNA。G12S-sgRNA的靶点为：cttgtggtagttggagctAg；G12S-sgRNA的全长序列为：cuugugguaguuggagcuAgguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc。WT-sgRNA的靶点为：cttgtggtagttggagctGg；WT-sgRNA的全长序列为：cuugugguag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种sgRNA，其靶序列长度为15‑25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20‑34位核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA，其靶序列长度为15-25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20-34位核苷酸。2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。3.具有权利要求2所述DNA分子的重组载体。4.一种药物，其活性成分为权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。5.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。6.如权利要求4所述的药物或如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症由特定癌细胞引起，所述特定癌细胞携带G...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵正琦，高千千，韩序，侯勇，王飞，李波，李燕珊，昃白尘，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44