本发明专利技术提供了一种产多糖的小单孢菌YG‑1菌株，属一种小单孢菌(Micromonospora sp.)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，保藏编号为：CCTCC M 2019054；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述小单孢菌YG‑1菌株能够用于发酵制备多糖。本发明专利技术提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受地、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决莼菜自然资源日益匮乏的现状，从而实现较高的经济效益。
A Polysaccharide-producing Micromonospora YG-1 Strain and Its Application
The invention provides a polysaccharide-producing Micromonospora strain YG_1, belonging to a Micromonospora sp., which is stored in a typical culture preservation center in China, address: China, Wuhan, Wuhan University; zip code 430072, preservation date is January 17, 2019, preservation number: CCTCC M 2019054; the 16S rDNA sequence of the strain is shown as SEQ ID NO.1. The Micromonospora YG_1 strain mentioned above can be used for fermentation to prepare polysaccharides. The strain provided by the invention can carry out large-scale fermentation cultivation in a short period of time, and the fermentation cost is low, and it is not limited by the conditions of land, season and so on. Therefore, the present situation of increasing scarcity of natural resources of water shield can be solved by microbial fermentation, so as to achieve higher economic benefits.
【技术实现步骤摘要】
一株产多糖的小单孢菌YG-1菌株及其用途
本专利技术涉及一种小单孢菌菌株，该菌株可产多糖，属于微生物
技术介绍
目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用微生物代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量的研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是经济型植物内生菌研究的广泛展开。随着人们对经济型植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀经济型植物资源紧缺的现状，必将成为将来经济型植物内生菌研究的重点。虽然植物内生菌尤其是经济型植物内生菌近些年来越来越受到广大学者的关注，但是目前仍然只开展了几百种植物的内生菌研究。莼菜(Braseniaschreberi)又名马蹄菜、湖菜、水葵、露葵、水荷叶、花案菜等，是多年生宿根性浮叶水生植物，属睡莲科莼属。莼菜表面的黏性果胶主要成分为黏性多糖，具有极高的营养价值。莼菜是一种重要的水生经济植物，其对水质的要求很高。在莼菜野生境环境日益恶化的当下，寻找一种莼菜多糖生产的替代途径显得尤为重要。莼菜内生菌近几年来才开始受到人们的关注，总体来说，关于莼菜内生菌尤其是能够代谢产生相应莼菜多糖成分的研究依然相对较少，鲜有关于产莼菜多糖的莼菜内生菌的报道。
技术实现思路
本专利技术解决了
技术介绍
中的问题，提供了一种产多糖的小单孢菌YG-1菌株，该菌株可产莼菜多糖。本专利技术人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为YG-1，属一种小单孢菌(Micromonosporasp.)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，保藏编号为：CCTCCM2019054；该菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。上述小单孢菌YG-1菌株能够用于发酵制备多糖。利用上述小单孢菌YG-1菌株制备多糖的方法包括以下步骤：首先将小单孢菌YG-1菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天，将发酵菌液于12000r/min离心，取上清液；将上清液与氯仿-正丁醇溶液混合于离心管中，振荡20-30min，再离心后取上清，将上清液用0.45μm的滤膜过滤两遍，过滤后在70℃下加热浓缩至原体积的1/2-2/3，加入4倍体积的95％乙醇，放入冰箱冷冻过夜，最后用12000r/min转速离心10min，所生成的沉淀即为多糖。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术所提供的小单孢菌YG-1菌株能够代谢产生多糖。所代谢产生的多糖与从天然莼菜中分离纯化到的多糖具有相同的HPLC波谱峰和相似的多糖红外波谱特征峰，以及相似或相同的化学功能团。并且该菌株发酵制备的多糖的生物学活性与天然莼菜多糖相比，对羟自由基的清除效显著高于天然莼菜多糖，具有更好的抗氧化活性。本专利技术提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受地、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决莼菜自然资源日益匮乏的现状，从而实现较高的经济效益。附图说明图1为本专利技术提供的菌株在培养基中的菌落形态图；图2为莼菜多糖提取物与本专利技术提供的菌株发酵产物多糖的高效液相(HPLC)分析图；图3为本专利技术提供的菌株发酵产物多糖的红外光谱分析图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细具体的说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。莼菜内生菌的分离取新鲜的莼菜的茎、叶和根，在无菌的环境下，先用升汞消毒再用蒸馏水漂洗几遍，接种到LB固体培养基上，避光培养。从培养基挑取出了生长良好的菌落移至新的LB培养基平板中，分别进行纯化、编号。本实施例中提供的菌株命名为YG-1号菌株，将该菌株的菌落移至新的LB培养基平板中生长良好，其菌落形态图如图1所示，图1中比例尺＝2mm。从图1中可以看出菌落直径约为1-2mm，形状为较规则的圆形，边缘光滑整齐，湿润，呈乳黄色且菌落表面较透明。莼菜内生菌的鉴定将分离纯化的内生菌经处理后(提取DNA或者煮沸处理)，扩增细菌16SrDNA序列(用27F/1492R引物)，扩增产物进行sanger测序，测序结果在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为内生菌的种属。16SrDNA序列扩增引物序列：引物127F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’引物21492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’扩增片段大小约1400-1700bp根据细菌的标准测序方法，测得上述莼菜内共生菌的序列如SEQIDNO.1所示，测序结果在NCBI网站上进行比对分析，结果表明，本实施例中提供的莼菜内共生菌为细菌，内生菌的拉丁属名为小单孢菌属(Micromonosporasp.)，菌种命名为YG-1。申请人将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年1月17日，专利菌种保藏编号为：CCTCCM2019054。莼菜内生菌多糖的制备从LB培养基平板中的菌分别挑取部分转移至纯化的菌株接种于LB液体培养基中，200r/min转速37℃过夜振荡培养2天，将发酵菌液于12000r/min离心5min，取上清液。配置氯仿-正丁醇溶液(氯仿：正丁醇＝4:1)，将上清液与有机溶液按3:1混合与离心管中，振荡20-30min，8000r/min离心10min后取上清，注意不能吸到两相之间的蛋白质沉淀。继续按上述操作进行5次除蛋白。将上清液用0.45μm的滤膜过滤两遍，过滤后在70℃下加热浓缩至原体积的1/2-2/3，加入4倍体积的95％乙醇，放入冰箱冷冻过夜，第二天用12000r/min转速离心10min，沉淀即为内生菌多糖。为比较本专利技术提供的莼菜内生菌的发酵液是否含有多糖，对内生菌发酵液提取物进行了多糖含量的测定。首先从天然莼菜中提取和分离出粗多糖作为参照物，方法如下：取莼菜嫩芽，放入NaOH(0.1mol/L)中浸提，料液比1:2(w/v)，25℃碱液浸提1.5h后调节pH至7.0。挑出莼菜芽，用离心机离心分离残渣，用磁力搅拌器将上清液在60℃浓缩1h。然后用sevage法反复处理浓缩的粗提液去除游离蛋白质，再次浓缩至原体积的2/3左右。加入四倍体积无水乙醇沉淀过夜，然后将混合物以4000r/min离心10min以获得沉淀物，用少量水溶解沉淀后浓缩再次加入四倍体积乙醇沉淀过夜，重复操作三次，最后干燥获得莼菜多糖(BSP)。测定方法如下：将多糖经硫酸水解后，采用DNS法(3-氨基-5-硝基水杨酸)测定菌液中的分泌糖含量，以D-葡萄糖醛酸为标准，首先通过不同浓度的葡萄糖标准液与DNS试剂、硫酸反应后的吸光度做出标准曲线。经测定，标准曲线为y＝0.0368x-0.0436(R2＝0.9807)。根据标准曲线，测定多糖的含量。实验结果表明，BSP样品中多糖的含量为0.30±0.01mg/mL，小单孢菌属YG-1菌株发酵提取物中的多糖含量为0.07±0.001mg/mL。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株产多糖的小单孢菌(Micromonospora sp.)YG‑1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019054，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一株产多糖的小单孢菌(Micromonosporasp.)YG-1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2019054，该菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述小单孢菌YG-1菌株的用途，其特征在于：用于发酵制备多糖。3.利用权利要求1所述小单孢菌YG-1菌株制备多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：首先将小单孢菌YG-1菌株接种...
【专利技术属性】
技术研发人员：余光辉，宫雅昕，覃瑞，龚汉雨，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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