本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种热稳性提高的融合型脂肪酶及其制备方法和应用，融合型脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，融合型脂肪酶由编码梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列中N端融合了一段由30～32个氨基酸组成的双亲短肽，所述的双亲短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。两种融合型脂肪酶具有较理想耐热特性，因此特别适合工业化大规模生产。
A Fusion Lipase with Enhanced Thermal Stability and Its Preparation and Application
The present invention belongs to the field of biotechnology and discloses a fusion lipase with improved thermal stability and its preparation method and application. The amino acid sequence of the fusion lipase is shown as SEQ ID NO.4 or SEQ ID NO.5. The fusion lipase is composed of an amphiphilic short peptide composed of 30-32 amino acids, which is fused by the N-terminal of the amino acid sequence encoding the lipase of Thermophila cardioides. The amino acid sequence of the amphiphilic short peptide is SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2. The two fusion lipases have ideal heat resistance, so they are especially suitable for large-scale industrial production.
【技术实现步骤摘要】
一种热稳性提高的融合型脂肪酶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，涉及两种融合型脂肪酶，具体为一种热稳性提高的融合型脂肪酶及其制备方法和应用。
技术介绍
脂肪酶是一类重要的水解酶，能够催化甘油三酯上酯键的水解。在特定的条件下还可以催化酸解、醇解、转酯、氨解、间接氧化还原等许多反应。以脂肪酶整体来看，它们具有底物多样性；具体到某一种酶的时候，又表现出很强的底物特异性。所有这些特性使得脂肪酶成为了重要的生物催化剂，被广泛应用于食品、化工、洗涤剂、医药、化妆品等领域。但是目前我国脂肪酶产品种类比较单一，能够产生重大工业价值的酶种有限，市售的酶制剂纯度也有待提高，对于有重要生产使用价值的酶种应该大力研究和开发。其中热稳定、高活力的脂肪酶更是具有无可比拟的开发和应用优势。疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的、具有重要工业价值的脂肪酶。但是野生菌产生脂肪酶需要培养温度高(80℃)，造成在实际生产中菌体培养条件苛刻，产品成本增加的问题，同时限制了脂肪酶在工业生产的应用。梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶工业生产损失量比较大，生产成本也会大幅度提高。若能将梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的热稳定性提高，则其生产成本也会随之下降。因此，本专利技术通过对梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因上的改造使其成为耐热性比较高的脂肪酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供提供一种融合型脂肪酶及其应用，旨在解决梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的耐热性较差和在工业生产上不理想的问题。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种热稳性提高的融合型脂肪酶，所述的融合型脂肪酶由梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在N端融合双亲短肽构成，所述的双亲短肽由30～32个氨基酸组成，所述的双亲短肽为双亲短肽1或双亲短肽2，其氨基酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。所述的梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。具体的，所述的融合型脂肪酶由梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQIDNO.3中在N端融合了一段由30～32个氨基酸组成的双亲短肽1或双亲短肽2而获得。本专利技术所述的融合型脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。所述的融合型脂肪酶的编码基因如SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。所述的融合型脂肪酶的酶促反应最适pH值为9.0；最适温度为50℃；在pH7-pH12、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在50％，在pH9-pH12、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在80％以上，脂肪酶融合双亲短肽1在80℃耐受45min残活在50％以上；脂肪酶融合双亲短肽2在80℃耐受35min残活在50％以上。在本专利技术的另一方面，所述的氨基酸序列SEQIDNO.4、SEQIDNO.5经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本专利技术的保护范围内。在本专利技术的另一方面，与所述的编码基因SEQIDNO.6、SEQIDNO.7编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本专利技术的保护范围内。在本专利技术的另一方面，本专利技术还包括携带有编码基因序列为SSEQIDNO.6或SEQIDNO.7的脂肪酶突变体的质粒。本专利技术一并提供上述所述的融合型脂肪酶的构建方法，包括以下步骤：1)设计引物F1和R1、F2和R2进行无模板PCR，从而获得双亲短肽1、双亲短肽2；再设计引物F3和R3、F3和R4分别将双亲短肽1、双亲短肽2进行PCR扩增；2)以梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，设计引物F4和R5、F5和R5分别进行PCR扩增脂肪酶1、脂肪酶2；3)以F3、R5为引物，分别以双亲短肽1与脂肪酶1、双亲短肽2与脂肪酶2为模版进行融合PCR扩增；4)将融合PCR扩增产物与载体进行重组；5)将5μL重组产物于50μLDH5α感受态细胞中，经冰浴冷却、热激，冷却后，加500μLLB培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分清液悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；6)进行阳性克隆子筛选验证，挑取单菌落于相应抗性的LB培养基中，培养2-3h后PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子测序。所述的引物序列具体如下：F1：GCTGAAGCTGAAGCTAAAGCTAAAGCTGAAGCTGAAGCTAAAGCTAAACCAACTCCACC；R1：AGTTGGAGTTGGAGTAGTTGGTGGAGTTGGAGTAGTTGGTGGAGTTGGTTTAGCTTTAG；F2：GCTGAAGCTGAAGCTAAAGCTAAAGCTGAAGCTGAACCGAAAGTCAGCCCGGAGGCTGT；R2：GAGCTCAGCCTCCTTCTTAACAGCCTCCGGGCTGACTTTCGGTTCAGCTTCAGCTTTAG；F3：GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTGAAGCTGAAGCTAAAGC；R3：TCTTCTAATAGGACTAGTTGGAGTTGGAGT；F4：AAGGAGGCTGAGCTCAGTCCTATTAGAAGA；R4：TCTTCTAATAGGACTGAGCTCAGCCTCCTT；F5：AAGGAGGCTGAGCTCAGTCCTATTAGAAGA；R5：TCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCAAGACATGTTCCAATTAAACCG。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了所述的融合型脂肪酶的基因的工程菌，所述的工程菌含有具有SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示基因的载体。所述的工程菌通过将SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。所述的编码基因EQIDNO.6或SEQIDNO.7的表达载体选自pPIC9K、pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C或PGAPZaA\B\C。在本专利技术另一方面，本专利技术所述的融合型脂肪酶在饲料添加剂中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的融合型脂肪酶的基因除与pPIC9K构建重组质粒外，还可以与pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌中，通过在平板中加入G418、Zeocin等抗生素，筛选获得脂肪酶基因工程菌，然后通过发酵获得新的脂肪酶。使其成为耐热性高的脂肪酶，这两种脂肪酶与野生型脂肪酶在高温下耐受经实验证明，80℃耐受25min脂肪酶融合双亲短肽1相对酶活大约还有69.87％，脂肪酶融合双亲短肽2相对酶活大约还有58.58％，而野生型脂肪酶仅仅剩余50.12％。在80℃时野生型脂肪酶相对酶活剩余一半时的时间大约为25min，而脂肪酶融合双亲短肽1相对酶活剩余一半时的时间大约为45min，脂肪酶融合双亲短肽2相对酶活剩余一半时的时间大约为35min。这两种脂肪酶的耐热性有了明显的提高，工业化生产中损失率有一定的降低。附图说明图1是本专利技术实施例提供的融合型脂肪酶的构建方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的最适pH的测定曲线图；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种热稳性提高的融合型脂肪酶，其特征在于，所述的融合型脂肪酶由梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在N端融合双亲短肽构成，所述的双亲短肽由30～32个氨基酸组成，所述的双亲短肽为双亲短肽1或双亲短肽2，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
【技术特征摘要】
1.一种热稳性提高的融合型脂肪酶，其特征在于，所述的融合型脂肪酶由梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在N端融合双亲短肽构成，所述的双亲短肽由30～32个氨基酸组成，所述的双亲短肽为双亲短肽1或双亲短肽2，其氨基酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。2.根据权利要求1所述的一种热稳性提高的融合型脂肪酶，其特征在于，所述的融合型脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。3.编码权利要求1所述的融合型脂肪酶的DNA分子。4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。5.权利要求1所述的融合型脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计引物F1和R1、F2和R2进行无模板PCR，从而获得双亲短肽1、双亲短肽2；再设计引物F3和R3、F3和R4分别将双亲短肽1、双亲短肽2进行PCR扩增；2)以梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，设计引物F4和R5、F5和R5分别进行PCR扩增脂肪酶1...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，姜占宝，苗华彪，韩楠玉，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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