一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，包括如下步骤：将金枪鱼骨蛋白与蒸馏水混匀，并进行加热加压处理，得到金枪鱼骨蛋白浆液；调节金枪鱼骨蛋白浆液pH，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，得到酶解液；将酶解液灭酶得到灭酶酶解液；将灭酶酶解液静置冷却，离心取上清液后再进行超滤处理，得胶原多肽粗液；将胶原多肽粗液依次加入到阴离子交换树脂层析柱中洗脱，葡聚糖凝胶柱层析中洗脱，采用高效液相色谱进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽。该金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，工艺安全、制备便捷。

Preparation of a Tuna Bone Collagen Polypeptide

The invention discloses a preparation method of tuna bone collagen polypeptide, which comprises the following steps: mixing tuna bone protein with distilled water, heating and pressurizing to obtain tuna bone protein serum; adjusting tuna bone protein serum pH and adding papain to enzymatic hydrolysis to obtain enzymatic hydrolysate; eliminating enzymatic hydrolysate to obtain enzymatic hydrolysate; After cooling and centrifugation, the supernatant was centrifuged and ultrafiltration was carried out to obtain collagen polypeptides crude liquid. Then the crude collagen peptide was added to the anion exchange resin column in order to eluate, and then eluted by Sephadex gel column chromatography, then purified by high performance liquid chromatography. The preparation method of the tuna bone collagen polypeptide is safe and convenient.

【技术实现步骤摘要】
一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法
本专利技术涉及多肽
，具体涉及一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法。
技术介绍
金枪鱼类，又叫鳍鱼、吞拿鱼，是硬骨鱼纲妒形目科鱼类中具有胸甲几个属鱼类的总称。金枪鱼体呈纺锤形，向后渐细尖而尾基细长，尾鳍叉状或新月形，尾柄两侧有明显的棱脊，背、臀鳍后方各有一行小鳍，肩部有由扩大之鳞片组成的胸甲。金枪鱼作为一种深海鱼类，素来以营养价值高、纯天然、无污染而享誉国际市场并有“海洋黄金”、“海底鸡”的美称，金枪鱼的DHA、EPA含量远高于秋刀鱼、鳝鱼、沙丁鱼、蛙鱼、竹荚鱼、鲤鱼等六种鱼类，每100g鱼肉的脂肪酸含量含量高达20.12％；金枪鱼肉热量和脂肪含量均低于其他肉类，而蛋白质含量高居首位，铁含量仅次于牛肉，维生素E的含量是仅次于它的肌肉的12倍多，营养价值显著；金枪鱼在加工过程中产生大量碎肉，常被加工成鱼粉饲料，利用价值较低。
技术实现思路
针对上述技术中存在的不足之处，本专利技术提供了一种工艺安全、制备便捷的金枪鱼骨胶原多肽的制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，包括如下步骤：步骤一、金枪鱼骨蛋白的制备；步骤二、将所述金枪鱼骨蛋白与蒸馏水混匀，并进行加热加压处理，得到金枪鱼骨蛋白浆液；步骤三、调节所述金枪鱼骨蛋白浆液pH，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，待酶解反应结束，得到酶解液；步骤四、将所述酶解液在沸水浴中灭酶8～15分钟，得到灭酶酶解液；步骤五、将所述灭酶酶解液静置冷却，离心取上清液后再进行超滤处理，即得胶原多肽粗液；步骤六、将胶原多肽粗液加入到阴离子交换树脂层析柱中，依次用双蒸水、NaCl溶液洗脱，得到离子交换层析物；步骤七、将离子交换层析物溶于双蒸水中配成离子交换层析物溶液，将其离心取上清液后再加入到葡聚糖凝胶柱层析中，再用双蒸水进行洗脱，得到凝胶层析物；步骤八、将所述凝胶层析物溶于双蒸水中配成凝胶层析物溶液，再采用高效液相色谱对其进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽。优选的，所述步骤一中金枪鱼骨蛋白的制备过程如下：将金枪鱼下脚料去头、尾、鳍，取其鱼肉骨架切段，并将其与中性蛋白酶溶液按料液比1:5～10混合，在温度为45～65℃，pH为7.5的条件下进行酶解脱肉2～3小时，得到金枪鱼骨架，所述金枪鱼骨架上的碎肉与所述金枪鱼骨架的质量比小于1:1000,再将所述金枪鱼骨架放入0.1mol/LNaOH溶液中搅拌20～30小时以除去杂蛋白，再用清水将其洗至中性，再置于100g/L、pH为7.2的乙二胺四乙酸二钠中，并在温度为3～5℃下搅拌脱钙处理4～6天，待金枪鱼骨架呈透明状时将其洗净，再用1mol/L的盐酸处理16～20小时，即得到柔软有韧性的金枪鱼骨蛋白。优选的，所述步骤二中：第一阶段，将金枪鱼骨蛋白与蒸馏水按料液比1：6～10混匀，并加热至75～80℃，在压力0.02～0.04Mpa下保温处理5～10分钟；第二阶段，以10～15℃/min的速度继续加热至85～90℃，在压力0.07～0.08Mpa下保温处理10～15分钟；第三阶段，以5～10℃/min的速度继续加热至100℃，以100℃的高温蒸汽继续保温处理15～20分钟，得到金枪鱼骨蛋白浆液。优选的，所述步骤三中调节所述金枪鱼骨蛋白浆液的pH至7～9，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解反应温度为55～65℃，酶解反应时间为4～5小时，待酶解反应结束，得到酶解液。优选的，所述木瓜蛋白酶的加酶量为金枪鱼骨蛋白浆液用量的1～2ug/g。优选的，所述步骤五中将灭酶酶解液静置冷却25～35分钟，温度降至40～50℃，离心取上清液后再进行超滤处理，即得胶原多肽粗液。优选的，所述步骤五中超滤处理采用超滤膜的孔径为20～30纳米，超滤温度为30～40℃，超滤压力为0.35～0.45MPa，超滤时间为20～30分钟。优选的，所述步骤六中将胶原多肽粗液加入到二乙氨基乙醇-52阴离子交换树脂层析柱中，再依次用双蒸水，0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液洗脱，得到离子交换层析物。优选的，所述步骤七中将离子交换层析物溶于双蒸水中配成浓度为10mg/mL的离子交换层析物溶液，将其离心取上清液后再加入到葡聚糖凝胶柱层析中，再用双蒸水进行洗脱，设置进样量为2.0～2.4mL，流速为0.6～1.0mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，得到凝胶层析物。优选的，所述步骤八中将所述凝胶层析物溶于双蒸水中配成浓度为70μg/mL的凝胶层析物溶液，再采用高效液相色谱对其进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽；其中，纯化处理时设置进样量为4～8μL，柱温为25～30℃，流动相为15％乙腈溶液，所述乙腈溶液中含有0.04～0.06％的三氟乙酸和0.002～0.004％的薄荷醇，洗脱速度为0.8mL/min，高效液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，所述改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度分别为100μmol/g和20μmol/g。本专利技术与现有技术相比，其有益效果是：本专利技术提供的金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，可以将低价值的金枪鱼下脚料转化为具有较高价值的金枪鱼骨胶原多肽，变废为宝，充分利用了资源；通过选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶，同时融合阴离子交换树脂层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱纯化，酶解过程易控制，同时制得的胶原多肽具有较高的活性；本专利技术制得的金枪鱼骨胶原多肽具有安全无毒副作用、易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。具体实施方式下面对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术提供了一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，包括如下步骤：步骤一、金枪鱼骨蛋白的制备：将金枪鱼下脚料去头、尾、鳍，取其鱼肉骨架切段，并将其与中性蛋白酶溶液按料液比1:5～10混合，在温度为45～65℃，pH为7.5的条件下进行酶解脱肉2～3小时，得到金枪鱼骨架，所述金枪鱼骨架上的碎肉与所述金枪鱼骨架的质量比小于1:1000,再将所述金枪鱼骨架放入0.1mol/LNaOH溶液中搅拌20～30小时以除去杂蛋白，再用清水将其洗至中性，再置于100g/L、pH为7.2的乙二胺四乙酸二钠中，并在温度为3～5℃下搅拌脱钙处理4～6天，待金枪鱼骨架呈透明状时将其洗净，再用1mol/L的盐酸处理16～20小时，即得到柔软有韧性的金枪鱼骨蛋白；步骤二、第一阶段，将金枪鱼骨蛋白与蒸馏水按料液比1：6～10混匀，并加热至75～80℃，在压力0.02～0.04Mpa下保温处理5～10分钟；第二阶段，以10～15℃/min的速度继续加热至85～90℃，在压力0.07～0.08Mpa下保温处理10～15分钟；第三阶段，以5～10℃/min的速度继续加热至100℃，以100℃的高温蒸汽继续保温处理15～20分钟，得到金枪鱼骨蛋白浆液；步骤三、调节所述金枪鱼骨蛋白浆液的pH至7～9，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，所述木瓜蛋白酶的加酶量为金枪鱼骨蛋白浆液用量的1～2ug/g，酶解反应温度为55～65℃，酶解反应时间为4～5小时，待酶解反应结束，得到酶解液；步骤四、将所述酶解液在沸水浴中灭酶8～15分钟，得到灭酶酶解液；步骤五、将灭酶酶解液静置冷却25本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、金枪鱼骨蛋白的制备；步骤二、将所述金枪鱼骨蛋白与蒸馏水混匀，并进行加热加压处理，得到金枪鱼骨蛋白浆液；步骤三、调节所述金枪鱼骨蛋白浆液pH，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，待酶解反应结束，得到酶解液；步骤四、将所述酶解液在沸水浴中灭酶8～15分钟，得到灭酶酶解液；步骤五、将所述灭酶酶解液静置冷却，离心取上清液后再进行超滤处理，即得胶原多肽粗液；步骤六、将胶原多肽粗液加入到阴离子交换树脂层析柱中，依次用双蒸水、NaCl溶液洗脱，得到离子交换层析物；步骤七、将离子交换层析物溶于双蒸水中配成离子交换层析物溶液，将其离心取上清液后再加入到葡聚糖凝胶柱层析中，再用双蒸水进行洗脱，得到凝胶层析物；步骤八、将所述凝胶层析物溶于双蒸水中配成凝胶层析物溶液，再采用高效液相色谱对其进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽。

【技术特征摘要】
1.一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、金枪鱼骨蛋白的制备；步骤二、将所述金枪鱼骨蛋白与蒸馏水混匀，并进行加热加压处理，得到金枪鱼骨蛋白浆液；步骤三、调节所述金枪鱼骨蛋白浆液pH，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，待酶解反应结束，得到酶解液；步骤四、将所述酶解液在沸水浴中灭酶8～15分钟，得到灭酶酶解液；步骤五、将所述灭酶酶解液静置冷却，离心取上清液后再进行超滤处理，即得胶原多肽粗液；步骤六、将胶原多肽粗液加入到阴离子交换树脂层析柱中，依次用双蒸水、NaCl溶液洗脱，得到离子交换层析物；步骤七、将离子交换层析物溶于双蒸水中配成离子交换层析物溶液，将其离心取上清液后再加入到葡聚糖凝胶柱层析中，再用双蒸水进行洗脱，得到凝胶层析物；步骤八、将所述凝胶层析物溶于双蒸水中配成凝胶层析物溶液，再采用高效液相色谱对其进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽。2.如权利要求1所述金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤一中金枪鱼骨蛋白的制备过程如下：将金枪鱼下脚料去头、尾、鳍，取其鱼肉骨架切段，并将其与中性蛋白酶溶液按料液比1:5～10混合，在温度为45～65℃，pH为7.5的条件下进行酶解脱肉2～3小时，得到金枪鱼骨架，所述金枪鱼骨架上的碎肉与所述金枪鱼骨架的质量比小于1:1000,再将所述金枪鱼骨架放入0.1mol/LNaOH溶液中搅拌20～30小时以除去杂蛋白，再用清水将其洗至中性，再置于100g/L、pH为7.2的乙二胺四乙酸二钠中，并在温度为3～5℃下搅拌脱钙处理4～6天，待金枪鱼骨架呈透明状时将其洗净，再用1mol/L的盐酸处理16～20小时，即得到柔软有韧性的金枪鱼骨蛋白。3.如权利要求1所述的金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤二中：第一阶段，将金枪鱼骨蛋白与蒸馏水按料液比1：6～10混匀，并加热至75～80℃，在压力0.02～0.04Mpa下保温处理5～10分钟；第二阶段，以10～15℃/min的速度继续加热至85～90℃，在压力0.07～0.08Mpa下保温处理10～15分钟；第三阶段，以5～10℃/min的速度继续加热至100℃，以100℃的高温蒸汽继续保温处理15～20分钟，得到金枪鱼骨蛋白浆液。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：武益正，雷芬芬，侯杰，胡传荣，徐庆菊，何东平，王新新，张四红，
申请(专利权)人：泰安市海之润食品有限公司，武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37