一种贝莱斯芽孢杆菌DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DH82，该菌于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16865；并公开利用该贝莱斯芽孢杆菌DH82制备其抗菌蛋白的方法，及该抗菌蛋白在水产养殖饲料添加剂中的应用；其抗菌蛋白能够有效防控水产病原菌引发的水产养殖动物的病害，从而保护水生动物健康生长，且能作为渔业养殖饲料添加剂显著提高水生动物机体免疫力，有着较好的应用前景。

Preparation and Application of Bacillus Belles DH82 and Its Antibacterial Protein

The invention discloses a Bacillus velezensis DH82, which is stored in the General Microbial Center of the Chinese Committee for the Preservation and Management of Microbial Species on Dec. 04, 2018, with the storage number CGMCC No. 16865, and a method for preparing its antimicrobial protein by using the Bacillus velezensis DH82, and the application of the antimicrobial protein in aquaculture feed additives. Antimicrobial proteins can effectively prevent and control diseases of aquatic animals caused by aquatic pathogens, thus protecting the healthy growth of aquatic animals, and can significantly improve the immunity of aquatic animals as feed additives in aquaculture, which has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种贝莱斯芽孢杆菌DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用
本专利技术涉及一种微生物菌株及其应用，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)DH82及其抗菌蛋白的制备方法和应用。
技术介绍
近年来，随着海洋渔业和水产养殖业的快速发展，我国养殖水体本身净化能力减弱、水环境污染、病原菌大量繁殖，极大地增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会。迟缓爱德华氏菌(Edwardsielatarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、坎氏弧菌(Vibriocampbelii)等水产细菌性致病菌，在海、淡水鱼的养殖过程中经常侵染鱼的皮肤及腮部，引发败血症，对水产养殖业构成较大的威胁并造成经济损失。因此，寻求安全、高效、生态的防治方法迫在眉睫。对于水产养殖过程中的细菌性病害防治，传统处理方法是使用化学抗生素，这易使原本没有抗生素抗性的细菌获得耐药性，培养出超级细菌，使细菌性病害防治更加困难。同时化学抗生素的大量使用和滥用，导致水产品药物残留，最终通过食物链进入到人体内，威胁食用者安全，在国内外的水产养殖受到极大的限制。因此，积极寻找和开发出能够有效抑制病原菌的化学抗生素替代物至关重要。深海是指水深大于1000米的海洋，广泛分布着海山、海盆和海沟等，有着热液口、冷泉、高压、高温、高污染等多种复杂独特生境。深海微生物在这极端生境中，往往能够产生结构和功能独特的生物活性物质，并与陆源活性物质结构和功能不同。其中，芽孢杆菌以其抗逆性强、稳定性好及能产生多种功能特异的活性物质而成为海洋极端生境微生物开发的重点，益生和抗菌功能是当前相关研究的热点。目前，针对贝莱斯芽孢杆菌应用于水产养殖细菌性病害防控专利寥寥无几。本专利技术涉及贝莱斯芽孢杆菌DH82在针对迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌等水产细菌性致病菌等有拮抗作用，在水产疾病的防治上有着极大应用价值。同时该菌株还兼具促进水产动物生长和提高水生动物机体免疫力的特点，是一种新型的多功能微生物。目前尚无贝莱斯芽孢杆菌在此方面的专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DH82，该菌株已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16865。本专利技术的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)DH82是从蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品筛选到产抗菌蛋白的菌株，结合形态学和生理生化特性，并对16SrDNA和gyrB基因进行生物信息学分析，最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌Bacilusvelezensis。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述的贝莱斯芽孢杆菌DH82制备其抗菌蛋白的方法，包括以下步骤：(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h；(2)发酵上清液的制备：将步骤(1)活化好的菌液按1～5％(V/V)接种到改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，10～35h，所有发酵液在5000～12000rpm，4℃，离心10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液；(3)抗菌蛋白的制备：于步骤(2)发酵上清液50～2000mL，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到40～100％，4℃过夜，于6000～10000rpm离心20～30min得沉淀物，用超纯水溶解，3000Da透析袋透析24～48h，冷冻干燥得贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白。本专利技术的又一目的在于贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白在制备水产养殖饲料添加剂中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌蛋白能够有效防控水产病原菌，如迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌，能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物的病害，从而保护水生动物健康生长，且能作为渔业养殖饲料添加剂显著提高水生动物机体免疫力，有着较好的应用前景。附图说明图1为菌株16SrDNA序列系统进化树。图2为菌株gyrB基因序列系统进化树。图3为温度对抗菌蛋白活性的影响。图4为蛋白酶对抗菌蛋白活性的影响。具体实施方式本专利技术中所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)DH82于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.16865。一、贝莱斯芽孢杆菌DH82分离与鉴定本专利技术贝莱斯芽孢杆菌(Bacilusvelezensis)DH82是从蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品筛选到产抗菌蛋白的菌株，结合形态学和生理生化特性，并对16SrDNA和gyrB基因进行生物信息学分析，最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌Bacilusvelezensis。1、菌株筛选(1)初筛：取5～10mL蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深海水样品，70～80℃恒温水浴20～30min，用无菌海水采用十倍稀释法进行梯度稀释，每个浓度各取100μL液体分别涂布在细菌分离培养基，28～37℃倒置培养24～48h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对细菌进行分离、纯化。上述细菌分离培养基为：NB(NutrientBroth)培养基(0.5％蛋白胨，3％牛肉膏，0.5％氯化钠，pH7.3)、M1培养基(1％淀粉，0.4％酵母粉，0.2％蛋白胨，pH7.3)和Zobell2216E培养基(0.5％蛋白胨，0.1％酵母提取物，天然过滤海水：纯水＝2:1(V/V)，pH7.6)；天然过滤海水为把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。(2)复筛：将上述筛得的贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h活化，活化后接种至300mL改良LB(LuriaBroth)培养基(1L锥形瓶)，接种量1％(V/V)，37℃，180rpm，24h后，发酵液离心(10000rpm，4℃，10min)弃菌体，加入固体硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到100％，4℃过夜，10000rpm离心30min后得沉淀物，所得沉淀物用3000Da透析袋除盐，冷冻干燥得抗菌蛋白样品。按改良琼脂扩散方法检测发酵液处理后的抑菌活性，进而筛选出产抗菌蛋白活性强的菌株，将该菌株标记为DH82。改良琼脂扩散法：取1.5mL新鲜的指示细菌液(迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌)在18mm×180mm试管培养37℃，180rpm，12h，于150mL的LB培养基46℃中，迅速摇匀倒入9cm规格的培养皿中，凝固后用直径为8.58mm无菌打孔器在抑菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块。每孔加入50μL待检测液，在超净台中吹干后置于37℃，培养12h后观察是否有抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。2、菌株鉴定将筛选所得DH82菌株接种至LB固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：DH82菌株微泛黄大菌落，边缘不规则，表面平整、干燥，革兰氏阳性，镜检呈杆状。DH82菌株能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DH82，已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16865。

【技术特征摘要】
1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DH82，已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16865。2.一种利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌DH82制备其抗菌蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌株活化：将贝莱斯芽孢杆菌DH82接种于改良LB培养基，25～40℃，150～220rpm，8～16h；(2)发酵上清液的制备：将步骤(1)活化好的菌液按1～5％(V/V)接种到改良LB培养基，25...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐长安，王青华，黄仕新，唐旭，罗曼，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35