一种虎奶菇的发酵培养方法以及从培养物中提取活性成分的方法技术

本发明专利技术提出了一种虎奶菇的发酵培养方法，该方法通过对虎奶菇最适培养温度、生长时间、摇床转速以及pH四个方面对其发酵条件进行研究，得到最适宜的发酵培养条件。本发明专利技术还提出了从得到的发酵培养物中提取活性成分的方法，该方法采用有机溶剂对得到的真菌菌丝进行提取，得到虎奶菇活性成分提取液。实验证明通过MTT法筛选出的虎奶菇有效成分具有抗肿瘤活性，对肺癌细胞的抑制率在80％以上。

A Fermentation and Culture Method of Pleurotus Tigris and a Method of Extracting Active Components from Culture

The invention provides a fermentation culture method of Lactarius cuspidatum. The method studies the fermentation conditions of Lactarius cuspidatum from four aspects: the optimum culture temperature, growth time, shaking speed and pH, and obtains the optimum fermentation culture conditions. The invention also provides a method for extracting active ingredients from the fermentation culture obtained. The method uses organic solvent to extract the mycelium of the fungus obtained, and obtains the extract of active ingredients of Pleurotus cuspidatum. The results showed that the active ingredients of Pleurotus tigrinus screened by MTT method had anti-tumor activity, and the inhibition rate of lung cancer cells was more than 80%.

【技术实现步骤摘要】
一种虎奶菇的发酵培养方法以及从培养物中提取活性成分的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，以及从得到的发酵培养物中提取活性成分的方法。
技术介绍
虎奶菇(Pleurtustuberregium)，又名核耳菇、菌核侧耳、茯苓侧耳、虎奶菌等，是生长于热带与亚热带地区的一种珍稀食用与药用真菌。虎奶菇的结构可分为菌丝体和子实体两部分，菌丝体存在于基质内，具有贮存、分解以及运输的功能。子实体存在于基质外，具有食用与繁殖的功能。菌核呈不规则的团块状，类似于圆形或者扁球形，大小不一，并且表面多为黄白色，少数呈浅黄色，成熟时外皮为红褐色，内部接近白色，体轻、质松，能浮于水面，有颗粒性，气微、味淡，嚼之有颗粒感，具有微黏性。菌盖形如漏斗或杯状，平整且中心下凹，初期肉质表面光滑，中部有小的平伏状鳞片，呈灰白色至红褐色。由于它对生长环境要求苛刻，自然生长周期长，因此随着环境的破坏，虎奶菇菌核的产量越来越少，难以满足医药及保健上的广泛应用。虎奶菇性味甘、温、补气益血，具有滋补强壮、健脾胃、降血脂、防病治病、提高免疫力以及消除肺部污染物的功效，同时也适用于动脉硬化、冠心病、高血压以及重症肌无力的治疗，并且对慢性、过敏性、虚寒型顽咳、哮喘也有较为神奇的疗效。此外虎奶菇的营养极为丰富，富含氨基酸、蛋白质、纤维素、真核多糖和矿物质等营养成分。在东南亚国家以及我国的沿海地区，虎奶菇主要作用为强壮补品来食用，同时也是一味能够止咳平喘的中药。虎奶菇的菌核具有极强的抗病能力，其成品放置在室内干燥的环境下，保存时间长，质不变，虫不蛀，病菌、病毒不侵，霉菌不入，药性功效不变，入药极佳。目前在国内外，虎奶菇的栽培方法与普通食用菌的栽培方法相近，如OkhuoyaJ.A.等用钻孔的塑料袋分别装香蕉叶、玉米棒子、废棉、稻草、麦秆等农业废料，接入虎奶菇菌丝，28～32℃黑暗培养3.5月，虎奶菇形成菌核并长出子实体，生物学效率香蕉叶最低，为13.58％；废棉最高，为30.11％。黄年来等自1993年起对虎奶菇的栽培方法进行了多方面的研究。在夏秋雨后，将子实体连同菌核挖出，经过晾出水分与表面灭菌的过程后在PDA培养基中获得纯菌种；使用阔叶树杂木屑、麸皮、棉籽壳等为培养基，在自然条件下，30℃～35℃袋料培养；30～45天洁白菌丝长满菌袋，4个月后可以采收菌核(120g-150g)。目前，虎奶菇人工栽培方法主要有两种，其一为袋培，利用木屑或者其他农作物秸秆麸皮培养料进行袋培，使之长出子实体或者形成菌棱；其二为利用阔叶树的短椴木进行窖栽，其方法和茯苓筒木窖栽方法相似，只是不能利用松木而已。虽然研究者普遍认为，液体深层发酵是生产菌丝最高效且产量最大的方法，但是有关虎奶菇液态培养获取菌种的工艺研究还需要完善。并需要对虎奶菇的有效成分进行药理药效分离提取。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种虎奶菇的发酵培养方法。本专利技术的第二目的在于提供从上述得到的发酵培养物中提取活性成分的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，所述液体培养基中含有土豆150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，无水硫酸镁0.3～0.8g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，琼脂5-6g/L，亚硒酸钠200～1000μg/L，余量为水。(2)将所述液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；(3)将所述发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。优选地，步骤(1)中，所述液体培养基通过以下方法制备得到：[1]将土豆切片后，加水煮沸4～7min，得到混合液；[2]将所述混合液过滤后得到滤液，并向所述滤液中加入无水硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将所述溶液定容至1000mL，得到所述液体培养基。优选地，步骤(1)中，所述液体培养基的pH值为5～8，优选为7。优选地，步骤(2)中，灭菌在高压蒸汽灭菌锅中进行，条件为121℃下灭菌20min。优选地，步骤(2)中，培养条件为在25℃，120r/min的转速下培养7天。本专利技术还涉及从所述虎奶菇发酵培养物中提取活性成分的方法，所述方法包括：向所述虎奶菇菌丝中加入有机溶剂浸泡，抽滤后得到滤液，所述滤液即为虎奶菇活性成分提取液。优选地，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙醚中的至少一种。优选地，所述浸泡时间为15～30h。优选地，将得到所述提取液蒸发浓缩后进行真空干燥，向得到膏状物中加入二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后在硅胶柱中用氯仿与甲醇的混合溶剂体系进行梯度洗脱，得到洗脱液。优选地，所述氯仿与甲醇的体积比为1：(1～9)。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种虎奶菇的发酵培养方法，该方法通过对虎奶菇最适培养温度、生长时间、摇床转速以及pH四个方面对其发酵条件进行研究，得到最适宜的发酵培养条件。本专利技术进一步采用有机溶剂对得到的真菌菌丝进行提取，得到虎奶菇活性成分提取液。实验证明通过MTT法筛选出的虎奶菇有效成分具有抗肿瘤活性，对肺癌细胞的抑制率在80％以上。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。本专利技术实施例涉及一种虎奶菇的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，该液体培养基中含有土豆150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，无水硫酸镁0.3～0.8g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，琼脂5-6g/L，亚硒酸钠200～1000μg/L，余量为水。在本专利技术的一个实施例中，该液体培养基通过以下方法制备得到：[1]将土豆切片后，加水煮沸4～7min，得到混合液；[2]将混合液过滤后得到滤液，并向滤液中加入无水硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将溶液定容至1000mL，得到液体培养基。进一步地，该液体培养基的pH值为5～8，优选为7时，最有利于菌丝生长。(2)将步骤(1)得到的液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；在本专利技术的一个实施例中，灭菌在高压蒸汽灭菌锅中进行，条件为121℃下灭菌20min。后续的培养条件为在25℃，120r/min的转速下培养7天。(3)将步骤(2)得到的发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。本专利技术还涉及从虎奶菇发酵培养物中提取活性成分的方法，该方法包括：向经上述发酵培养得到的虎奶菇菌丝中加入有机溶剂浸泡15～30h，优选24h，抽滤后得到滤液，所得滤液即为虎奶菇活性成分提取液。在本专利技术的一个实施例中，有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、乙醚中的至少一种，上述有机溶剂的极性依次增加。进一步地，将得到的提取液蒸发浓缩后进行真空干燥，向得到膏状物中加入二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后在硅胶柱中用氯仿与甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虎奶菇的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，所述液体培养基中含有土豆150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，无水硫酸镁0.3～0.8g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，琼脂5‑6g/L，亚硒酸钠200～1000μg/L，余量为水；(2)将所述液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；(3)将所述发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。

【技术特征摘要】
1.一种虎奶菇的发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备液体培养基，所述液体培养基中含有土豆150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，无水硫酸镁0.3～0.8g/L，磷酸二氢钾0.5～1.5g/L，琼脂5-6g/L，亚硒酸钠200～1000μg/L，余量为水；(2)将所述液体培养基灭菌后，进行无菌接种，并在24～29℃，100～180r/min的转速下培养5～9天，得到发酵培养物；(3)将所述发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体培养基通过以下方法制备得到：[1]将土豆切片后，加水煮沸4～7min，得到混合液；[2]将所述混合液过滤后得到滤液，并向所述滤液中加入无水硫酸镁、磷酸二氢钾、亚硒酸钠、葡萄糖和琼脂，煮沸使其完全溶解，得到溶液；[3]将所述溶液定容至1000mL，得到所述液体培养基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体培养基的pH值为5～8...

【专利技术属性】
技术研发人员：单保恩，姚清国，姚定一，赵连梅，桑梅香，张静，刘飞，米梦粽，
申请(专利权)人：河北医科大学第四医院，
类型：发明
国别省市：河北,13