一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡及其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡及其制备方法和使用方法，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；与废液区连接的收集区；所述述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀。本发明专利技术通过微流控技术控制待测样品的流速和流量，具有同一种标志物的黑色素肿瘤细胞通过一条微通道进入检测区，避免相互干扰，从而减少误差，增加反应灵敏度；将待测样品制备成水包水微液滴，增大检测限度。

A combined quantitative detection card for melanoma cells and its preparation method and application method

【技术实现步骤摘要】
一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡及其制备方法和使用方法
本专利技术涉及微流控技术和免疫荧光微球免疫层析技术相结合的
，具体涉及一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡及其制备方法以及定量检测黑色素肿瘤细胞的方法。
技术介绍
黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤，常见于皮肤，亦见于黏膜、眼脉络膜等部位。在亚洲人和有色人种中，原发于皮肤的黑色素瘤占50％～70％，最常见的原发部位为肢端(约占所有黑色素瘤的50％)，即足底、足趾、手指末端及甲下等部位，其次为粘膜黑色素瘤(约占20％左右)，而欧美白种人这两种亚型仅占所有黑色素瘤的5％。欧美白种人中过度的紫外线照射是明确病因之一。紫外线可致使皮肤灼伤，并诱导DNA突变，进而诱导黑色素瘤发生。此外，光敏型皮肤、存在大量普通痣或发育异常痣以及皮肤癌家族史者均为高危人群。不恰当的处理有可能诱发色素痣恶变和迅速生长，如刀割、绳勒、盐腌、激光和冷冻等局部刺激。内分泌、化学、物理因素对黑色素瘤的发生是否有影响还不得而知。黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，容易出现远处转移。早期诊断和治疗因而显得尤为重要。目前对于黑色素瘤的诊断与监测手段主要有S100蛋白、糖蛋白肿瘤抗原-免疫复合物(TA90-IC)、乳酸脱氢酶(LDH)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF)等血清肿瘤标志物检测。微流控技术(Microfludics)是指在至少有一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中控制体积为皮升至纳升的流体进行流动并传质、传热的技术。实现微流控操控的主要方法就是将流体限制在一个微米甚至纳米尺度的通道中，流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流、液滴等等。当微通道在微米甚至纳米尺度时，微通道表面积与其内部体积比很大，通道的结构、形状和壁面性质都对流体的流动状态产生极大影响。因此，微流控可以实现一系列常规方法难以完成的微加工和微操作。时间阀的作用就是在固定的时间内控制通过微通道的流体的流速和流量，可以严格控制整个反应的时间并且控制进入检测区的流体的量。荧光微球是指将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。目前临床检验黑色素肿瘤的手段，诸如血清鉴定、医学影像扫描、组织病理学切片等。如利用血清鉴定，由于个体差异导致有些黑色素肿瘤缺乏高度特异性的标志物不能被有效检出，其可靠性较差；医学影像扫描可以非侵入地、快速地对患者的黑色素肿瘤情况进行评估，但即使是最先进准确的影像检测方法,黑色素肿瘤检出直径至少也要在2～3mm，即小于该直径范围的黑色素肿瘤通过影像学检查往往不能被发现，所以只能应用于癌症中晚期的检测；组织病理学切片往往根据穿刺或术后取出的黑色素肿瘤组织才能鉴定，且技术要求较高，无法做到反复多次、长期或随时获取，此外，该方法还具有一定的创伤性且不能准确判定是否有转移情况发生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡及其制备方法和使用方法，其灵敏度高、操作简单、携带方便且制备成本低。使用的荧光微球基本不受外界环境介质变化的影响，稳定性好，染料荧光猝灭大大减少。使用微流控技术设置时间阀的孔径在8μm，使得黑色素肿瘤细胞能够通过时间阀并富集。具体技术方案如下：一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；通过微通道与废液区连接的收集区；所述述结合区、检测区、废液区、收集区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。所述结合区和检测区均为5个，结合区A、B、C、D、E分别喷涂有荧光微球A标记的抗S100抗体、荧光微球B标记的抗TA90-IC抗体、荧光微球C标记的抗LDH抗体、荧光微球D标记的抗NSE抗体、荧光微球E标记的抗BRAF抗体；检测区A、B、C、D、E分别包被有抗S100抗体、抗TA90-IC抗体、抗LDH抗体、抗NSE抗体、抗BRAF抗体。进一步地，荧光微球A的粒径0.51μm、激发波长660nm、发射波长690nm；荧光微球B的粒径0.52μm、激发波长480nm、发射波长520nm；荧光微球C的粒径0.51μm、激发波长360nm、发射波长420nm；荧光微球D的粒径0.87μm、激发波长550nm、发射波长590nm；荧光微球E的粒径0.9μm、激发波长395nm、发射波长410nm。所述加样区覆盖圆形滤纸；所述检测区覆盖长方形滤纸条；所述圆形滤纸直径为1.5-2.0cm、孔径为1-3μm；所述长方形滤纸条直径为2cm×7cm。所述微通道通过软光刻技术和微流控芯片技术制备，所述微通道孔径为10-15μm；所述时间阀孔径为8μm。所述的底卡和面卡材质为PMDS；所述底卡和面卡的背面扣合连接。本专利技术还提供了所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)底卡的制备：(1-1)制图；(1-2)掩模；(1-3)光刻；(1-4)再铸模；(1-5)软光刻；(2)在底卡的结合区分别喷涂荧光微球标记的抗体；(3)在底卡的检测区分别包被抗体；(4)将直径1.5-2.0cm、孔径为1-3μm的圆形滤纸覆盖在加样区，直径为2cm×7cm的长方形滤纸条覆盖检测区；(5)将所述底卡和面卡的背面扣合连接。所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)制图：微通道图形按照设计通过绘图软件绘制掩膜版图；(1-2)掩模：制成掩膜版图后，打印在透明胶片上制得光刻掩膜板,利用此掩膜板通过光刻工艺制作硅片模具；(1-3)光刻：在基片表面镀上一层阻挡层，再用甩胶机在阻挡层上均匀地甩上一层光敏材料-光刻胶；在光掩模上制备所需的通道图案；将光掩模复盖在基片上，用紫外光照射涂有光刻胶的基片，光刻胶发生光化学反应；用光刻胶配套显影液通过显影的化学方法除去经曝光的光刻胶；烘干后，利用未曝光的光刻胶的保护作用，采用化学腐蚀的方法在阻挡层上精确腐蚀出底片上平面二维图形，制成所需硅片模具；(1-4)再铸模：通过将弹性材料涂于光刻形成的硅片模具表面，干燥后取下则硅片模具表面上图形转移到弹性材料上形成印模；(1-5)软光刻：将PMDS前聚体与固化剂按10:1比例混合，搅拌混匀后，置于真空箱内脱除气泡，然后在印模上浇注，PMDS前聚体在印模上完全摊平后，将其连同印模一起放入烘箱内进行固化，置于80℃烘箱固化约48小时，之后将PMDS基片从印模上剥离下来。本专利技术还提供了所述黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡的使用方法，包括以下步骤：(a)将血清标准品包裹成8μm的水包水微液滴，配制成5个以上的一系列浓度，用同一批次的数张检测卡检测各浓度的标准品溶液，以检测区的荧光强度为纵坐标，血清标准品溶液浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，包括底卡和面卡，其特征在于，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；通过微通道与废液区连接的收集区；所述结合区、检测区、废液区、收集区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。

【技术特征摘要】
1.一种黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，包括底卡和面卡，其特征在于，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；通过微通道与废液区连接的收集区；所述结合区、检测区、废液区、收集区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。2.根据权利要求1所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，其特征在于，所述结合区和检测区均为5个，结合区A、B、C、D、E分别喷涂有荧光微球A标记的抗S100抗体、荧光微球B标记的抗TA90-IC抗体、荧光微球C标记的抗LDH抗体、荧光微球D标记的抗NSE抗体、荧光微球E标记的抗BRAF抗体；检测区A、B、C、D、E分别包被有抗S100抗体、抗TA90-IC抗体、抗LDH抗体、抗NSE抗体、抗BRAF抗体。3.根据权利要求1或2所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，其特征在于，所述加样区覆盖圆形滤纸；所述圆形滤纸直径为1.5-2.0cm、孔径为1-3μm；所述收集区覆盖滤纸。4.根据权利要求1或2所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，其特征在于，所述微通道通过软光刻技术和微流控芯片技术制备，所述微通道孔径为10-15μm；所述时间阀孔径为8μm。5.根据权利要求1或2所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡，其特征在于，所述的底卡和面卡材质为PDMS；所述底卡和面卡的背面扣合连接。6.根据权利要求1-5任意一项所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)底卡的制备：(1-1)制图；(1-2)掩模；(1-3)光刻；(1-4)再铸模；(1-5)软光刻；(2)在底卡的结合区分别喷涂荧光微球标记的抗体；(3)在底卡的检测区分别包被抗体；(4)滤纸覆盖加样区和收集区；(5)将所述底卡和面卡的背面扣合连接。7.根据权利要求6所述的黑色素肿瘤细胞联合定量检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)制图：微通道图形按照设计通过绘图软件绘制掩膜版图；(1-2)掩模：制成掩膜版图后，打印在透明胶片上制得光刻掩膜板,利用此掩膜板通过光刻工艺制作硅片模具；(1-3)光刻：在基片...

【专利技术属性】
技术研发人员：周辉，
申请(专利权)人：周辉，
类型：发明
国别省市：安徽,34