一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法技术

本发明专利技术属于分析生物分子相互作用领域，公开了一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，将碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，将蛋白溶液分散在碳纳米管周围，利用表面等离子体共振光强度的变化确定蛋白溶液与等离子共振传感芯片上的单根碳纳米管的结合动力学曲线。本发明专利技术所述分析方法基于表面等离子体共振成像技术(SPRM)可以免去荧光标记制样的繁琐复杂，实现不同的单根碳纳米管与蛋白原位作用的实时免标记分析成像。

A Method for Analyzing the Interaction between Single Carbon Nanotubes and Proteins

【技术实现步骤摘要】
一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法
本专利技术属于研究生物分子相互作用领域，具体涉及一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，尤其是涉及一种基于表面等离子体共振成像技术(SPRM)分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法。
技术介绍
碳纳米管又名巴基管，是一种具有特殊结构(径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量级，管子两端基本上都封口)的一维纳米材料。碳纳米管主要由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管。碳纳米管可以看做是石墨烯片层卷曲而成，因此按照石墨烯片的层数可分为：单壁碳纳米管和多壁碳纳米管，多壁管在开始形成的时候，层与层之间很容易成为陷阱中心而捕获各种缺陷，因而多壁管的管壁上通常布满小洞样的缺陷。碳纳米管的独特结构使其具有许多优良的功能，如比表面积大、强度高、韧性好、密度小、导热性和导电性优良等。碳纳米管因其优异的性质，广泛应用于力学、能源、纳米器件、电子器件、传感器、催化等领域，其中在超级电容器领域已经实现产业化。碳纳米管具有独特的中空结构和纳米管径以及优良的细胞穿透性能，随着纳米药物的兴起，碳纳米管常常作为药物的载体，运载生物活性分子进入细胞运送到人体内且不产生毒性。碳纳米管在水溶液中的稳定分散和与蛋白质分子的作用是实现其生物医学应用的重要研究内容,常涉及到纳米材料与蛋白质是否特异性作用等基础问题,也辐射到纳米材料的生物安全性问题，因此研究碳纳米管与人体中血液蛋白的相互作用至关重要。目前检测蛋白与碳纳米管的相互作用的方法主要有扫描电镜(SEM)成像技术、原子力显微镜(AFM)成像技术、全内反射荧光显微镜(TIRF)成像技术。但扫描电镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)仅可成像却无法得到结合动力学曲线，最终无法得到结合速率常数、解离速率常数等相关信息。而全内反射荧光显微镜(TIRF)由于需要借助荧光标记的方法，所以往往导致制备样品过程复杂，且荧光标记会干扰正常样品的状况，不利于进行原位观察。除此之外，荧光标记常常会发生淬灭漂白的现象，无法进行长时间的观察。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基于表面等离子体共振成像技术(SPRM)检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，可以免去荧光标记制样的繁琐复杂，实现不同的单根碳纳米管与蛋白原位作用的实时免标记检测成像。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，将蛋白溶液分散在碳纳米管周围，利用表面等离子体共振光强度的变化确定蛋白溶液与等离子共振传感芯片上的单根碳纳米管的结合动力学曲线。优选的，所述检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法包含以下步骤：1)碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，盖上聚二甲基硅氧烷反应池；2)在60×镜头下向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，采集SPR图像，建立标准基线；3)待基线稳定后向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入蛋白溶液，连续采集图像，得到相应的结合图像；4)待结合达到最大值平台附近时，再次向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，采集SPR图像，得到相应的解离图像；5)根据结合图像和解离图像得到结合解离曲线计算获得结合速率常数、解离速率常数。其中，作为优选，步骤1)所述预处理为经羧基修饰获得的羧基多壁碳纳米管于乙醇溶液中超声，水相滤膜过滤，取过滤后的上清液。更优选的，所述水相滤膜孔径d＝0.22μm。作为优选，步骤1)所述等离子共振传感芯片由依次设置的基底材料、铬层、金层构成。在一些实施方案中，所述基底材料为普通玻璃；所述铬层厚度为2-3nm，所述金层厚度为40-50nm。在具体实施例中，所述等离子共振传感芯片的制备方法为在玻璃基底上镀一层2-3nm厚的镉层，再镀一层40-50nm厚的金膜。作为优选，步骤1)所述单分子层修饰为等离子共振传感芯片表面用带SH的PEG-OH修饰得到PEG-OH表面，可以抑制金膜表面的非特异性结合屏蔽蛋白对金膜的干扰。在一些实施方案中，所述等离子共振传感芯片上单分子层的制备方法为将等离子共振传感芯片放置于1mM的PEG-OH溶液中在0℃下浸泡24h，使等离子共振传感芯片表面形成单层均匀的单分子层。本专利技术所述检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法步骤2)向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，建立标准基线。其中所述PBS的pH值为7。作为优选，步骤2)所述采集SPR图像时SPR的光强强度在1/3IntensityMAX处。本专利技术所述检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法步骤3)向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入蛋白溶液可以使碳纳米管与蛋白发生非特异性结合，得到结合图像。作为优选，步骤3)所述蛋白溶液为含牛血清蛋白或麦胚凝集素的PBS溶液。在一些实施方案中，所述蛋白溶液中牛血清蛋白或麦胚凝集素浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL或1mg/mL。作为优选，步骤3)所述采集图像的速度为106fps。本专利技术所述检测单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法步骤4)向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，可以使吸附在碳纳米管上的蛋白发生部分解离得到相应的解离图像。进一步的，作为优选，本专利技术所述方法采用自动给药系统向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS或蛋白溶液，可以实现快速给药。所述自动给药系统结构如图1所示。将PBS装入容器1中，打开阀门1，向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS溶液，即为Ⅰ阶段。之后快速关上阀门1，同时打开阀门2，向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入蛋白溶液，即为Ⅱ阶段。最后快速关上阀门2，快速打开阀门1，向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中再次加入PBS溶液，即为Ⅲ阶段。所述自动给药系统可以调至在离碳纳米管(MWNT)2μm的上方位置，且响应切换时间在1s左右。作为优选，所述PBS或蛋白溶液的流速为1s/drop。作为优选，步骤5)所述计算方法为利用ImageJ分别读出碳纳米管上的SPR强度，记作SPRIntensityMWNT-COOH；PEG-OH修饰的金膜表面强度，记作SPRIntensityPEG-OH；之后用SPRIntensityMWNT-COOH减去SPRIntensityPEG-OH，得到扣除背景干扰的SPRIntensityMWNT-COOH，之后利用Matlab去噪平滑，得出碳纳米管上与蛋白的结合解离曲线，将结合解离曲线的结合部分代入公式(1)，解离部分代入公式(2)，联合公式(1)(2)可求得碳纳米管的Ka、Kd，再由公式(3)可求得碳纳米管的KD。KD＝Ka/Kd(3)其中Rt表示随时间变化的碳纳米管SPRIntensityMWNT-COOH，Rmax表示碳纳米管最大的SPRIntensityMWNT-COOH，[A]表示蛋白BSA的浓度，t表示时间，Ka表示结合速率常数，Kd表示解离速率常数，KD表示碳纳米管与蛋白的亲和力。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下有益效果之一：(1)本专利技术所述检测方法简便、实时、高效，只需将蛋白通过给药系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，将蛋白溶液分散在碳纳米管周围，利用表面等离子体共振光强度的变化确定蛋白溶液与等离子共振传感芯片上的单根碳纳米管的结合动力学曲线。

【技术特征摘要】
1.一种分析单根碳纳米管与蛋白相互作用的方法，碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，将蛋白溶液分散在碳纳米管周围，利用表面等离子体共振光强度的变化确定蛋白溶液与等离子共振传感芯片上的单根碳纳米管的结合动力学曲线。2.根据权利要求1所述的方法，包含以下步骤：1)碳纳米管经预处理后旋涂于单分子层修饰的等离子共振传感芯片上，盖上聚二甲基硅氧烷反应池；2)在60×镜头下向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，采集SPR图像，建立标准基线；3)待基线稳定后向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入蛋白溶液，连续采集图像，得到相应的结合图像；4)待结合达到最大值平台附近时，再次向等离子共振传感芯片上的聚二甲基硅氧烷反应池中加入PBS，采集SPR图像，得到相应的解离图像；5)根据结合图像和解离图像得到结合解离曲线计算获得结合速率常数、解离速率常数。3.根据权利要求2所述的方法，步骤1)所述预处理为碳纳米管经羧基修饰后于乙醇溶液中超声，水相滤膜过滤，取过滤后的上清液。4.根据权利要求2所述的方法，步骤1)所述等离子共振传感芯片由依次设置的基底材料、铬层、金层构成；所述单分子层修饰为等离子共振传感芯片表面用带SH的PEG-OH修饰得到PEG-OH表面。5.根据权利要求2所述的方法，步骤2)所述采集SPR图像时SPR的光强强度在1/3IntensityMAX处。6.根据权利要求2所述的方法，步骤3)所述蛋白溶液为含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤伟，朱丽萍，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34