鉴别或辅助鉴别甘草的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别甘草的方法，通过测序，若叶绿体基因序列psbA‑trnH第270位点为T碱基，则该待测乌拉尔甘草是新疆产甘草，若叶绿体基因序列psbA‑trnH第270位点为C碱基，则该待测甘草为新疆之外产地产甘草。

Methods for identification or auxiliary identification of licorice

The present invention relates to a method for identifying or assisting the identification of licorice based on single nucleotide polymorphism markers. By sequencing, if the 270th locus of chloroplast gene sequence psbA trnH is T base, the tested Ural licorice is Xinjiang licorice. If the 270th locus of chloroplast gene sequence psbA trnH is C base, the tested licorice is Xinjiang licorice.

【技术实现步骤摘要】
鉴别或辅助鉴别甘草的方法
本专利技术涉及一种鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，该方法可用于对新疆产甘草进行鉴别。
技术介绍
甘草为豆科甘草属药材，《中国药典》规定甘草药材植物来源为甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎。市场上甘草药材以甘草(又称乌拉尔甘草)来源为主，其产地多分布于新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等省份。目前在甘草种子市场上，不同产地甘草的种子价格差异显著，新疆产甘草的种子价格普遍比其他产地(包括内蒙、甘肃、吉林等省份)低近一半左右。这就导致在市场交易及流通过程中，新疆产甘草的种子经常混杂在其他产地的种子中进行销售。而从甘草种子的外观形态方面很难准确区分新疆产甘草。分子标记技术如RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA标记)、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(SimpleSequenceRepeat，简单重复序列标记)等结果可重复性差、工作量大、成本高。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指发生在染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。在漫长的进化过程中，生物体形成了自身特有的DNA碱基序列，比较不同物种间或同一物种不同地方品种间的SNP差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物信息学，从而对不同物种或同一物种不同地方的品种进行精细鉴定和分类。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单个核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。
技术实现思路
本专利技术涉及一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，运用分子生物学的分子标记技术，对不同产地的甘草植物样本进行DNA提取，PCR扩增，引物筛选及生物信息学分析，找到快速准确鉴别新疆产甘草的方法。专利技术人通过大量阅读文献以及实地调研等方式确定甘草的主产区。甘草目前主要分布在新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古等地，野生与栽培均有资源分布。通过深入甘草主产区，与当地种植大户沟通，采集了大量正品的甘草野生与栽培样本。通过对采集的样本进行DNA提取，运用不同的序列引物进行PCR扩增，并测序，通过生物信息学分析比对序列，筛选的序列包括核基因序列ITS(Internaltranscribedspacer，内转录间隔区)与ITS2(Internaltranscribedspacer2)，叶绿体基因序列psbA-trnH(主要是指psbA与tRNA-Hisintergenicspacerregion间隔区序列)、rbcL(ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit)、matK(maturaseK)。运用MEGA软件进行序列比对与分析，找到可以稳定准确鉴别新疆产甘草的引物序列(在该序列某一位点或某几个位点，新疆产甘草与其它产地样本的碱基均不一样，且各自一致)。通过最终数据比对筛选，发现叶绿体基因组psbA-trnH序列可以将新疆产甘草与其它产地甘草进行鉴别。经过序列比对分析，发现在psbA-trnH序列中的270位点(psbA-trnH序列为独立的序列，有其固定的组成部分，为psbA、psbA-trnHintergenicregion、trnH，虽然不同物种之间各组成部分的长度不同，但同一物种或其近缘种的psbA-trnH序列的长度是基本一致的。而且通过MEGA软件进行序列比对后，每条序列的碱基均相对应，保证每条序列都是在270位点处产生碱基突变)，呈现规律性的突变碱基(SingleNucleotidePolymorphisms，单核苷酸多态性，SNP变异位点)。新疆产甘草在psbA-trnH序列的270位点为T碱基，其它产地的甘草在psbA-trnH序列的270位点为C碱基(如图1所示)。基于此，本专利技术提供一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，其包括以下步骤：1)提取待测甘草的DNA；2)通过测序，若叶绿体基因序列psbA-trnH第270位点为T碱基，则该待测甘草是新疆产甘草，若叶绿体基因序列psbA-trnH第270位点为C碱基，则该待测甘草是其它产地甘草。在本专利技术优选的实施方式中，可以加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行测序。优选的是，应用psbA-trnH序列的fwdPA/revTH引物(fwdPA/revTH引物对)对模板进行PCR扩增。在本专利技术优选的实施方式中，可以加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行电泳检测。优选的是，扩增产物为约200bp的DNA片段。本专利技术涉及一种用于鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的引物对，其可以选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，引物对2的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，引物对3的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。本专利技术涉及一种用于鉴别或辅助鉴别新疆产甘草的方法，其包括以下步骤：1)提取待测甘草的DNA作为模板；2)采用至少一种引物对作为PCR扩增引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；3)检测扩增产物。进一步地，所述检测为分子水平的检测。如可以为杂交、基因芯片、PCR检测等。PCR检测简便易行，因此，优选为PCR检测。在本专利技术优选的实施方式中，所述引物对选自：引物对1、引物对2和引物对3，其中，引物对1的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，引物对2的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，引物对3的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在本专利技术优选的实施方式中，引物对1的PCR条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。在本专利技术优选的实施方式中，引物对2的PCR条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。在本专利技术优选的实施方式中，引物对3的PCR条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。在本专利技术优选的实施方式中，可以通过琼脂糖凝聚电泳来检测所述扩增产物，若电泳显示出现扩增条带，则表明该待测甘草是新疆产甘草。优选的是，所述的扩增条带的分子量是约200bp。在本专利技术优选的实施方式中，可以在扩增后的反应体系中加入荧光染料，例如荧光染料SYBRGreenI，若检测到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则表明该待测甘草是新疆产甘草。优选的是，含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长下进行检测的。本专利技术还提供了鉴别新疆产甘草或辅助鉴别新疆产甘草的PCR试剂，其可以含有至少一种上述的引物对，该PCR试剂可以用于检测待测甘草是否是新疆产甘草或是否含有新疆产甘草。本专利技术还提供了鉴别新疆产甘草或辅助鉴别新疆产甘草的试剂盒，其可以含有至少一种上述的引物对或者至少一种上述的PCR试剂。该试剂盒为鉴定新疆产甘草提供了便利。在本专利技术优选的实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别甘草的方法，其包括以下步骤：1)提取待测甘草的DNA作为模板；2)通过测序，若叶绿体基因序列psbA‑trnH第270位点为T碱基，则该待测乌拉尔甘草是新疆产甘草，若叶绿体基因序列psbA‑trnH第270位点为C碱基，则该待测甘草为新疆之外产地产甘草。

【技术特征摘要】
1.一种基于单核苷酸多态性标记的鉴别或辅助鉴别甘草的方法，其包括以下步骤：1)提取待测甘草的DNA作为模板；2)通过测序，若叶绿体基因序列psbA-trnH第270位点为T碱基，则该待测乌拉尔甘草是新疆产甘草，若叶绿体基因序列psbA-trnH第270位点为C碱基，则该待测甘草为新疆之外产地产甘草。2.权利要求1所述的方法，还含有以下步骤：加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进行测序。3.权利要求2所述的方法，应用psbA-trnH序列的fwdPA/revTH引物(fwdPA/revTH引物对)对模板进行PCR扩增。4.权利要求1所述的方法，还含有以下步骤：加入引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后对扩增产物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继永，郑司浩，邓庭伟，尚兴朴，刘美娟，李进瞳，曾燕，史玉宝，
申请(专利权)人：中国中药有限公司，国药种业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11