一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，该方法利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料一步糖基化反应生产莱鲍迪苷E，同时采用定点突变技术，改造UDP‑糖基转移酶，进一步提高莱鲍迪苷E的产率。本发明专利技术的方法无需添加UDP‑葡萄糖和UDP，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E。其中，莱鲍迪苷E产率可达65%以上；后期通过定点突变技术，经筛选获得N358F有益突变体，其催化莱鲍迪苷E产率提高，最高可达85%以上。与已有的莱鲍迪苷E制备方法相比，工艺步骤简单，成本低廉，且产率高，具有重要的应用价值。

An Enzymatic Method for the Preparation of Lebatidin E

The present invention discloses an enzymatic method for the preparation of lebatidin E. The method utilizes UDP glycosyltransferase from tomato and sucrose synthetase from potato to produce lebatidine E by one-step glycosylation reaction with stevioside as raw material. Meanwhile, the site-directed mutagenesis technology is used to modify UDP glycosyltransferase and further improve the yield of lebatidine E. The method of the invention does not need to add UDP glucose and UDP, and uses UDP in crude extract and additional sucrose to obtain UDP glucose as raw material for glycosylation reaction under the decomposition of sucrose synthase, establishes a double enzyme cycle reaction system, and effectively catalyzes the production of rebaudioside E by stevioside. Among them, the yield of Lybodioside E can reach more than 65%. By site-directed mutagenesis technology, N358F mutant was screened and its catalytic yield of Lybodioside E can be increased up to 85%. Compared with the existing preparation methods of lebatidin E, the process is simple, low cost and high yield, which has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法。
技术介绍
甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250～450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用[1,2]，因此，越来越受到人们的关注。甜菊糖是甜菊糖甙(Steviolglycosides)的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙[3]，包括甜菊甙(Stevioside)和莱鲍迪苷A、B、C、D、E、M(RebsudiosideA/B/C/D/E/M)等。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C13位羟基和C19位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C16-C17之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团[3,4]。不同甜菊糖甙的甜度有所差异[5]，莱鲍迪苷E(RebaudiosideE)的口感无后苦味，甜度与蔗糖相似，其结构上较甜菊甙在骨架上的C19位侧链上多了一个葡萄糖基团，在甜叶菊的干叶片中含量甚微(远小于1％)，直接通过常规物理手段从甜菊糖甙中分离莱鲍迪苷E，难度大且收率极低。专利申请CN201110379733.7(一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法)和专利申请CN201010131126.4(一种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法)中均采用的是环糊精葡萄糖基转移酶催化合成甜菊糖苷，但是该酶不能只将单一的葡萄糖残基添加到甜菊糖苷底物分子上，其催化产物是较为复杂的混合物，后期分离难度较大。专利申请CN201410185097.8(甜菊苷生成莱鲍迪苷E的生物转化方法)和专利申请CN201210288703.X(甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的方法)中采用的是利用黑曲霉菌CICC40430发酵，每24h添加甲醇诱导表达糖基转移酶(70～75kDa)并纯化，其转化率≥70％，但是黑曲霉菌生长周期长，且需要在培养过程中添加乙醇作为诱导剂，操作复杂，产量不高。本方法通过生物酶催化手段，以甜菊甙纯品为原料一步糖基化反应制备莱鲍迪苷E，工艺步骤简单，成本低廉，且产率高，具有重要的应用价值。参考文献[1]KOVYLYAEVAGI,BAKALEINIKGA,STROBYKINAIY,etal.GlycosidesfromSteviarebaudiana[J].ChemistryofNaturalCompounds,2007,43(1):81-85.[2]KINGHORNAD,KINGHORNAD.Stevia:thegenusStevia[J].CrcPress,2002.[3]OLSSONK,CARLSENS,SEMMLERA,etal.Microbialproductionofnext-generationsteviasweeteners[J].MicrobCellFact,2016,15(1):207-220.[4]UPRETIM,DUBOISG,PRAKASHI.Syntheticstudyontherelationshipbetweenstructureandsweettastepropertiesofsteviolglycosides[J].Molecules,2012,17(4):4186-4196.[5]BRANDLEJE,TELMERPG.Steviolglycosidebiosynthesis[J].Phytochemistry,2007,68:1855-1863.
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前直接从甜叶菊干叶片中，仅通过叶片碾碎、物理吸附、提纯等手段难以大量获取制备莱鲍迪苷E且经济效率低下的问题，提供一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，利用糖基转移酶UGTSL2糖基化作用，一步催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E，为莱鲍迪苷E的制备及精制提供有力基础。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E；其中，所述UDP-糖基转移酶为番茄来源糖基转移酶UGTSL2或者其突变体。所述自诱导发酵过程中诱导剂在发酵培养液中浓度为0.01～0.5％，诱导剂可以为乳糖。所述UDP-糖基转移酶为番茄来源的UDP-糖基转移酶基因UGTSL2，为NCBIReferenceSequence:NC_015448.3，基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列(Uniprotnumber:K4D508)见SEQ.No.3所示；所述蔗糖合成酶为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，为NCBIReferenceSequence:M18745，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列(Uniprotnumber:P10691)见SEQ.No.4所示。所述基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的共表达的载体的重组大肠杆菌；UGTSL2基因片段插入在质粒载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体的NcoI和EcoRI酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1，将重组质粒热击转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂布于含有50mg/L的卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，获得共表达的重组大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌诱导表达条件为：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中，于16～37℃、200rpm振荡培养8～10h，再将培养菌液按2％接种量接入TB培养基中，其中诱导剂乳糖在TB培养液中浓度为0.01～0.5％，于16～37℃诱导培养16～36h，离心收集菌体。所述双酶循环反应催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E的体系为：底物甜菊甙的起始反应浓度为2～60g/L，蔗糖与甜菊甙的质量比为1～10，由共表达上述两个酶的基因工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为1～25mg/mL，加水定容至1～100mL，pH值为6～8，于20～50℃反应1～48h。所述对UDP-糖基转移酶采用定点突变技术，获取并筛选有益突变体，是通过将目标氨基酸序列与多组其他UDP-糖基转移酶氨基酸序列(包括：UniProtKB/Swiss-Prot:Q6VAB4、Q7XJ50、A6XNC6和Q9LK73)进行比对分析，在活性中心部位区间所选定的一个最有可能的关键位点；最终UDP-糖基转移酶定点突变的位点确定为N358；所述突变的氨基酸位点发生突变包括：N358A，N358C，N358D，N358E，N358F，N358G，N358H，N358I，N358K，N358L，N358M，N358P，N358Q，N358R，N358S，N358T，N358V，N358W，N358Y。其中，N358F突变体氨基酸序列见SEQ.No.5。本专利技术发现了番茄来源糖基转移酶UGTSL2(51kDa)可一步催化甜菊甙糖基化合成莱鲍迪苷E，其可以在甜菊甙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP‑糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E；其中，所述UDP‑糖基转移酶为番茄来源糖基转移酶UGTSL2或者其突变体。

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E；其中，所述UDP-糖基转移酶为番茄来源糖基转移酶UGTSL2或者其突变体。2.根据权利要求1所述的一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，所述番茄来源糖基转移酶UGTSL2的基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列见SEQ.No.3所示；所述蔗糖合成酶为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列见SEQ.No.4所示。3.根据权利要求1所述的一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，所述基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的共表达的载体的重组大肠杆菌；所述自诱导发酵过程中诱导剂在发酵培养液中浓度为0.01~0.5%。4.根据权利要求1所述的一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，所述细胞粗提液为发酵得到的菌体经超声或低温高压破碎所获得的含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液。5.根据权利要求1所述的一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，陈量量，贾红华，潘华祎，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32